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DH5알파에 Transformation 효율을 높이는 방법을 알려주세요.

2006-05-01 org.kosen.entty.User@5ba10261 김은경(reiauska)
  • 2
안녕하세요.제가 몇달동안 cloning만하고있는데요. 계속cloning이 되지 않아요.ㅜ.ㅜ insert는 630bp, 2802bp, 3108bp정도 크기이구요, vector는 pGADGH로 크기는 7800bp정도됩니다. primer도 확인했지만 이상이 없었습니다. insert가 3108bp를 자르는 enzyme은 Apa1, Sal1(apa1처리후 실활하여 Sal1처리)입니다. 630bp,2802bp정도는 bamH1, EcoR1을 동시에 처리합니다.그런후 gel extraction한뒤 ligation하여 trasnsformation을 합니다. DH5알파는 사용하기 하루전에 competente cell로 만든후 4도씨에서 보관합니다. heat shock을 이용하여 transformation하구요, LB배지를 cell에 넣고 37도씨에서 45분정도 incubation한뒤에 LA plate에 spreading을 합니다. ligation 전에 벡터와 insert를 같이 loading하여 계산하여 넣는데두 불구하고 colony가나오지 않거나 나와도 insert가 없습니다. 이상한 것은 vector를 자른후 gel extraction처리하여서 self ligation을 막았는데도 불구하고 insert가 없습니다.어디서 어떤 과정이 잘못되어서 cloning이 안되는 것일까요? 제발 가르쳐주세요
  • transformation
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답변 2
  • 답변

    임상면님의 답변

    2006-05-02
    • 0
    > 안녕하세요.제가 몇달동안 cloning만하고있는데요. 계속cloning이 되지 않아요.ㅜ.ㅜ >insert는 630bp, 2802bp, 3108bp정도 크기이구요, vector는 pGADGH로 크기는 7800bp정도됩니다. >primer도 확인했지만 이상이 없었습니다. insert가 3108bp를 자르는 enzyme은 Apa1, Sal1(apa1처리후 실활하여 Sal1처리)입니다. 630bp,2802bp정도는 bamH1, EcoR1을 동시에 처리합니다.그런후 gel extraction한뒤 ligation하여 trasnsformation을 합니다. DH5알파는 사용하기 하루전에 competente cell로 만든후 4도씨에서 보관합니다. heat shock을 이용하여 transformation하구요, LB배지를 cell에 넣고 37도씨에서 45분정도 incubation한뒤에 LA plate에 spreading을 합니다. ligation 전에 벡터와 insert를 같이 loading하여 계산하여 넣는데두 불구하고 colony가나오지 않거나 나와도 insert가 없습니다. 이상한 것은 vector를 자른후 gel extraction처리하여서 self ligation을 막았는데도 불구하고 insert가 없습니다.어디서 어떤 과정이 잘못되어서 cloning이 안되는 것일까요? 제발 가르쳐주세요 무슨 방법으로 만드시는지는 모르겠지만 강제로 DNA를 넣기 위해 competent cell을 만드는 조건이 셀에게 좋은건 아닙니다. 그래서 만드신 후에 바로 deep freezer에 얼려서 보관하세요. 아마 4도씨에서 보관 하시면 효율이 급격히 떨어질겁니다. 그리고 한번 녹은건 다시 쓰지 마시구요.. 그리고 ligation 양을 좀 많이 하시거나 따로 한 세트를 더 하셔서 젤에서 확인 후 하시는것도 확실한 방법중에 하나입니다. 특히 큰 싸이즈의 경우엔 더 확실히 하셔야 합니다. 경우에 따라선 18도씨 이하의 낮은 온도에서 일주일 정도 오래 ligation시키는것이 나을 수도 있고 2Kb 넘어갈 경우 CIP 처리도 중요한 요인입니다. 마지막으로 자세한 프로토콜이 없으신 관계로 노파심에.. ^^ heat shock 주신후 ice에서 2분정도 확실히 식힌 후 37도씨 pre-warmed media를 넣어서 키우세요.
    답변수정
    > 안녕하세요.제가 몇달동안 cloning만하고있는데요. 계속cloning이 되지 않아요.ㅜ.ㅜ >insert는 630bp, 2802bp, 3108bp정도 크기이구요, vector는 pGADGH로 크기는 7800bp정도됩니다. >primer도 확인했지만 이상이 없었습니다. insert가 3108bp를 자르는 enzyme은 Apa1, Sal1(apa1처리후 실활하여 Sal1처리)입니다. 630bp,2802bp정도는 bamH1, EcoR1을 동시에 처리합니다.그런후 gel extraction한뒤 ligation하여 trasnsformation을 합니다. DH5알파는 사용하기 하루전에 competente cell로 만든후 4도씨에서 보관합니다. heat shock을 이용하여 transformation하구요, LB배지를 cell에 넣고 37도씨에서 45분정도 incubation한뒤에 LA plate에 spreading을 합니다. ligation 전에 벡터와 insert를 같이 loading하여 계산하여 넣는데두 불구하고 colony가나오지 않거나 나와도 insert가 없습니다. 이상한 것은 vector를 자른후 gel extraction처리하여서 self ligation을 막았는데도 불구하고 insert가 없습니다.어디서 어떤 과정이 잘못되어서 cloning이 안되는 것일까요? 제발 가르쳐주세요 무슨 방법으로 만드시는지는 모르겠지만 강제로 DNA를 넣기 위해 competent cell을 만드는 조건이 셀에게 좋은건 아닙니다. 그래서 만드신 후에 바로 deep freezer에 얼려서 보관하세요. 아마 4도씨에서 보관 하시면 효율이 급격히 떨어질겁니다. 그리고 한번 녹은건 다시 쓰지 마시구요.. 그리고 ligation 양을 좀 많이 하시거나 따로 한 세트를 더 하셔서 젤에서 확인 후 하시는것도 확실한 방법중에 하나입니다. 특히 큰 싸이즈의 경우엔 더 확실히 하셔야 합니다. 경우에 따라선 18도씨 이하의 낮은 온도에서 일주일 정도 오래 ligation시키는것이 나을 수도 있고 2Kb 넘어갈 경우 CIP 처리도 중요한 요인입니다. 마지막으로 자세한 프로토콜이 없으신 관계로 노파심에.. ^^ heat shock 주신후 ice에서 2분정도 확실히 식힌 후 37도씨 pre-warmed media를 넣어서 키우세요.
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  • 답변

    정철웅님의 답변

    2006-05-02
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    comptent cell의 상태를 먼저 검토 해보세요. 1ug의 supercoil DNA가 몇 개의 colony를 형성하는지 확인 해 보시기 바랍니다. 10^9이면 더할 나위 없겠지만 10^6이하이면 파는 것을 사서 해 보시기 바랍니다. 최소한 10^7을 추천합니다. 그 때마다 만들어서 쓰는 것이면 시간 조절 잘하셔서 가장 신선할 때 사용하시기 바랍니다. 또 ligation도 확인 해 보세요. 4도, 16도, 37 도에서 ligation 해 보시고 gel 달려 보시기 바랍니다. 문제가 있을 때는 본인 밖에 확인 못합니다. insert vector ratio도 다양하게 조사해 보셔야 됩니다. 제 경험상 위의 두개만 확인되면 클로닝에 별 문제 없었습니다.
    답변수정
    comptent cell의 상태를 먼저 검토 해보세요. 1ug의 supercoil DNA가 몇 개의 colony를 형성하는지 확인 해 보시기 바랍니다. 10^9이면 더할 나위 없겠지만 10^6이하이면 파는 것을 사서 해 보시기 바랍니다. 최소한 10^7을 추천합니다. 그 때마다 만들어서 쓰는 것이면 시간 조절 잘하셔서 가장 신선할 때 사용하시기 바랍니다. 또 ligation도 확인 해 보세요. 4도, 16도, 37 도에서 ligation 해 보시고 gel 달려 보시기 바랍니다. 문제가 있을 때는 본인 밖에 확인 못합니다. insert vector ratio도 다양하게 조사해 보셔야 됩니다. 제 경험상 위의 두개만 확인되면 클로닝에 별 문제 없었습니다.
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