2006-05-09
org.kosen.entty.User@43d1871
강일남(inkang99)
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Protein work 경험이 전혀 없는 사람입니다.
제가 이번에 his-tagged protein을 만들어 보려고 하고 있습니다. Vector는 pET17b를 사용하고 있구요, his-tag은 PCR primer에 histidine sequence를 넣었습니다. 그리고, his-tag을 어느 쪽에 넣어야 할지 판단하기가 쉽지 않아서 N-terminal 쪽과 C-terminal 쪽 각각을 만들어 보고 있습니다.
다행히 PCR, ligation, 그리고 DH5α 로의 transformation 까지는 순조롭게 진행이 되었습니다. 그리고, miniprep해서 sequencing 결과도 제대로 나오는 것을 확인했습니다.
그런데, miniprep한 plasmid들을 BL21(DE3)로 transformation 하는 과정에서 좀 문제가 생기네요. N-terminal 쪽에 tag을 붙인 건 아무 문제가 없는데요, C-terminal 쪽에 tag을 붙인 건 transformation이 안 됩니다. 그런데, C-terminal 쪽에 tag이 붙은 plasmid 중에 실험과정에서 좀 잘못되어서 rbs(ribosome binding site)와 start codon 사이가 정상인 경우보다 7bp 가 길어진 경우(그러니까, translation이 잘 안 될 것 같은 경우)는 또 transformation 이 잘 되네요.
결과를 어떻게 해석해야 할지 조언을 부탁드립니다.
참고로 제가 his-tag을 붙여 정제하고자 하는 protein은 transcription factor입니다.
- His-tagged protein
- DH5α
- BL21(DE3)
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
김남철님의 답변
2006-05-31- 0
다른 균주 몇가지를 테스트 해보심이 좋을 듯 합니다. Leaky expression 을 막는 plys 계열의 균주를 한번 사용해 보시기 바랍니다. 님이 말씀하신 대로라면 translation이 제대로 되는 경우는 균주가 살아남지 못한다는 말이 되니 leaky expression을 막아보는 것이 한가지 대응법일 수 있겠습니다. 그래서 안되면 여러가지 vector와 cell을 테스트 해보는 수 밖에 없겠네요... >Protein work 경험이 전혀 없는 사람입니다. > >제가 이번에 his-tagged protein을 만들어 보려고 하고 있습니다. Vector는 pET17b를 사용하고 있구요, his-tag은 PCR primer에 histidine sequence를 넣었습니다. 그리고, his-tag을 어느 쪽에 넣어야 할지 판단하기가 쉽지 않아서 N-terminal 쪽과 C-terminal 쪽 각각을 만들어 보고 있습니다. > >다행히 PCR, ligation, 그리고 DH5α 로의 transformation 까지는 순조롭게 진행이 되었습니다. 그리고, miniprep해서 sequencing 결과도 제대로 나오는 것을 확인했습니다. > >그런데, miniprep한 plasmid들을 BL21(DE3)로 transformation 하는 과정에서 좀 문제가 생기네요. N-terminal 쪽에 tag을 붙인 건 아무 문제가 없는데요, C-terminal 쪽에 tag을 붙인 건 transformation이 안 됩니다. 그런데, C-terminal 쪽에 tag이 붙은 plasmid 중에 실험과정에서 좀 잘못되어서 rbs(ribosome binding site)와 start codon 사이가 정상인 경우보다 7bp 가 길어진 경우(그러니까, translation이 잘 안 될 것 같은 경우)는 또 transformation 이 잘 되네요. > >결과를 어떻게 해석해야 할지 조언을 부탁드립니다. > >참고로 제가 his-tag을 붙여 정제하고자 하는 protein은 transcription factor입니다.