2006-06-22
org.kosen.entty.User@29b0a171
김인규(kidarime)
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올해부터 Hela cell에서 Genomic DNA를 뽑아서 해당부분 PCR 후 cloning 작업을 하고 있는데, 반년이 지나도록 안되는 게 있어서 ㅠㅠ
PCR은 3663/2663/1663bp 짜리 3개를 하는데 초반엔 1663 -> 3663으로 갈 수록 product의 양이
적어서 잘 안되었지만 여러 조건을 잡아서 PCR product의 농도도 진하게 되었습니다.
- Polymerase는 taq이 아닌 Pfu를 사용합니다. taq은 이상하게도 안되더라구요 ㅡㅡ;;
다음으로 ToPo vector(Zero Blunt ToPo PCR Cloning Kit)에 일단 옮기는 작업을 하는데, 여기서부터 안됩니다. 물론 Insert의 크기가 꽤 크기 때문에 잘 안된다는 것은 알지만...
vector를 dilution 해도, Insert의 농도가 작다고 생각되어 PCR을 여러개 해서 1개로 모아서 써봐도, PCR Product에 잡밴드가 많다고 생각되어 해당부분 밴드만 Gel에서 잘라서 해봐도...
아직 한 번도 Cloning 된 게 없네요. ㅠㅠ 아~ 난감합니다. 1663/2663은 그나마 되는데, 왜 나머지 하나가 안될까요. 딱 사람 돌기 좋네요 ㅋㅋㅋㅋ
비도오고, 실험도 하도 안되고 해서 주저리 주저리 하다 갑니다. ㅡ_ㅡ;
- Zero Blunt
- One shot competent cell
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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정철웅님의 답변
2006-06-22- 0
안된다는 것이 colony가 안 뜬다는 것인가요? 아니면 콜로니가 생기는데 insert가 이상한 것인가요? 제 경우는 4Kb를 하면서 2달 고생한적이 있었는데, 후자의 경우였습니다. insert가 길수록 엉뚱하게 recombination 될 수 있습니다. 제 경우는 벡터는 원래대로 사용하고 insert 양을 조절 해 본 결과, 오히려 적은 양의 insert를 썼을 때 성공했습니다. 한 번 고려해 보시길 바랍니다. 한편으로는 윗 분이 말씀하신 것처럼 나눠서 클로닝 하시는 것도 좋습니다. 사이즈가 크니 엔자임 사이트는 충분 할 것 같네요. >올해부터 Hela cell에서 Genomic DNA를 뽑아서 해당부분 PCR 후 cloning 작업을 하고 있는데, 반년이 지나도록 안되는 게 있어서 ㅠㅠ > >PCR은 3663/2663/1663bp 짜리 3개를 하는데 초반엔 1663 -> 3663으로 갈 수록 product의 양이 >적어서 잘 안되었지만 여러 조건을 잡아서 PCR product의 농도도 진하게 되었습니다. >- Polymerase는 taq이 아닌 Pfu를 사용합니다. taq은 이상하게도 안되더라구요 ㅡㅡ;; > >다음으로 ToPo vector(Zero Blunt ToPo PCR Cloning Kit)에 일단 옮기는 작업을 하는데, 여기서부터 안됩니다. 물론 Insert의 크기가 꽤 크기 때문에 잘 안된다는 것은 알지만... > >vector를 dilution 해도, Insert의 농도가 작다고 생각되어 PCR을 여러개 해서 1개로 모아서 써봐도, PCR Product에 잡밴드가 많다고 생각되어 해당부분 밴드만 Gel에서 잘라서 해봐도... > >아직 한 번도 Cloning 된 게 없네요. ㅠㅠ 아~ 난감합니다. 1663/2663은 그나마 되는데, 왜 나머지 하나가 안될까요. 딱 사람 돌기 좋네요 ㅋㅋㅋㅋ > >비도오고, 실험도 하도 안되고 해서 주저리 주저리 하다 갑니다. ㅡ_ㅡ; -
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김인규님의 답변
2006-06-22- 0
두 분의 조언으로 다시 한번 활로를 찾은 것 같아서 무겁던 마음이 한결 가벼워 집니다. ^^ 비록 온라인상이지만 감사의 마음을 전하며, 추가 답변 등 남깁니다. 먼저 Kimem님. “A-tailing은 하셨으리라 믿습니다.“에서 Poly A-tagging을 말씀하시는 거 맞죠? 근데, Pfu로 PCR하면 당연 Blunt-end... 제가 질문할 때 벡터를 'ToPo'를 사용한다고 말씀드렸습니다만.. Blunt-end Product를 끼우기 위한 형태로 되어진 것에 poly-a를 붙여주면... 제가 머리가 딸려서 부족합니다. ^^; 4도씨에서 overnight incubation을 해보려다가 사용하는 Kit이 짧은 시간내에 cloning을 할 수 있도록 강구된 것이라, 오히려 overnight 하면 안 좋을 것 같아서 시도를 안해왔는데 com.cell 재구입하는 데로 한번 해봐야겠네요. 근데, protocol을 보면 상온에서 incubation하라고 되어있거든요. ccw0312님. 제 경우, 콜로니는 생기지만 insert가 이상한 것이 맞습니다. self-ligation이 대부분이었고, 얼마전에 ligation 시간을 30분으로 늘리자 3kb가까이 다른 insert가 clon 된 것을 확인할 수 있었습니다. 적은 양의 insert를 썼을 때 성공하셨다고 했는데, 흠..지금껏 topo voctor를 1/10로 희석해서 사용했거든요. 한번 생각해 보겠습니다. com.cell이 다시 들어오는 데로 실험해보고 좋은 소식 전해드리겠습니다. ㅡㅡ;; -
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김은민님의 답변
2006-06-22- 0
TOPO cloning의 기본 개념은 TA cloning으로 알고 있답니다. TA cloning이란 PCR product가 Taq으로 PCR 할경우 3'end에 A가 tailing됩니다. poly A tailing이 아니라 하나의 A가 3'end에 붙는 것입니다. TA clonig은 이러한 성질을 이용하여 발달된 cloning 방법으로서 TOPO vector을 이용하기때문에 TOPO cloning이라고 한답니다. 그런데 pfu polymerase는 이러한 Taq polymerase의 특성이 없기때문에 pfu고 PCR 한 후에는 Taq을 소량 첨부하여 3'end에 A를 붙이는 작업을 하는 것이지요. 그런데 요즈음 pfu 기능도 하면서 Taq의 기능도 하는 여러 polymerase가 발달되고 있어서, 굳이 A-tailing하지 않아도 되는 pfu가 있기는 한답니다. 님께서 1kb와 2kb는 이 pfu를 이용하여 (A-tailing) TOPO cloning을 하셨다니 아마도 두가지 기능을 다 가지고 있는 pfu인 듯하네요. product를 생산한지 오래되거나, Gel purify한 후엔 A-tailing해주면 efficiency가 상당히 높아진답니다*^^* 도움이 되셨으면 좋겠구요*^^* 건승하세요! -
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김은민님의 답변
2006-06-22- 0
A-tailing은 하셨으리라 믿습니다. pfu로 PCR하시고 Gel purify한 product는 cloning하기전 바로 A-tailing하여 사용하셨지요? fresh할수록 좋습니다!! insert가 크면 클수록 efficiency가 급격하게 낮아집니다. 3.3 kb의 product는 condition을 잡아야할 것같으네요. TOPO cloning시에 ligation을 5분만 하시지 마시고.. 4oC에서 overnight incubation을 해본다던지, insert양을 조절하신다던지.. 저도 큰 사이즈를 어렵게 성공한 경험이 있어서.. 근데 3.3 kb는 많이 크네요~ 방법하나는 3.3 kb product를 둘로 나눠서 PCR한 후 두 clone을 합치는 방법이 있겠습니다. 전 긴 유전자는 대부분 이렇게 진행했습니다. pfu라고 할지라도 PCR error는 있을수 있으니까요.. 마음고생하고.. 걱정하는 시간보다 이 길이 빠르기도 하지요~~ 건승을 빕니다!! >올해부터 Hela cell에서 Genomic DNA를 뽑아서 해당부분 PCR 후 cloning 작업을 하고 있는데, 반년이 지나도록 안되는 게 있어서 ㅠㅠ > >PCR은 3663/2663/1663bp 짜리 3개를 하는데 초반엔 1663 -> 3663으로 갈 수록 product의 양이 >적어서 잘 안되었지만 여러 조건을 잡아서 PCR product의 농도도 진하게 되었습니다. >- Polymerase는 taq이 아닌 Pfu를 사용합니다. taq은 이상하게도 안되더라구요 ㅡㅡ;; > >다음으로 ToPo vector(Zero Blunt ToPo PCR Cloning Kit)에 일단 옮기는 작업을 하는데, 여기서부터 안됩니다. 물론 Insert의 크기가 꽤 크기 때문에 잘 안된다는 것은 알지만... > >vector를 dilution 해도, Insert의 농도가 작다고 생각되어 PCR을 여러개 해서 1개로 모아서 써봐도, PCR Product에 잡밴드가 많다고 생각되어 해당부분 밴드만 Gel에서 잘라서 해봐도... > >아직 한 번도 Cloning 된 게 없네요. ㅠㅠ 아~ 난감합니다. 1663/2663은 그나마 되는데, 왜 나머지 하나가 안될까요. 딱 사람 돌기 좋네요 ㅋㅋㅋㅋ > >비도오고, 실험도 하도 안되고 해서 주저리 주저리 하다 갑니다. ㅡ_ㅡ; -
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권정은님의 답변
2006-06-23- 0
편리해서 우리 랩에서 많이 쓰는데 제가 알기로 tailing을 할 필요가 없습니다. 일단 백터에 topo가 달려있구^^ 일정 시퀀스가 있으면 topo가 알아서 연결해주는 것이 아닌지요.. 아니면 랩에서 사용하는 kit이 매우 좋은 것인지... V5 tag 되는 걸로 쓰고 있는데요...음... PCR product 경우에도 다를 바 없을 것 같은데...kit이 좋은가... 혹시 topo를 따로 넣어주는 거라면 다를 지 모르겠습니다만, 이 경우라면 보통 벡터에 비해 메리트가 없어 보입니다. tailing이 랩에서 한다고 하면 100% 되는 것도 아니라 회사에서 나온 것을 쓰는 것이 나으리라 생각합니다..(간혹 안 좋은 회사 것은 TA cloning 시 차라리 tailing 하는 것이 좋을 때도 있어요..^^;) tailing까지 해서 쓰는 벡터라면 굳이 topo 있는 벡터를 사용 안 하는게 낫지 않을까요.. kit 세대라...^^;;; 클로닝이 안되는 경우 중에서 특히 cDNA PCR 경우 amplifiy 된 유전자가 사이즈가 맞지만 원하는 경우가 아닐 때가 있습니다. 우선 pcr한 프라이머로 prodoct 를 시퀸싱을 하셔서 amplify가 된 것이 원하는 유전자인지 확인해 보는 것도 좋을 것 같습니다. 보통은 벡터에 넣은 후 시퀸싱하려하시지만요...근데 반년이면... 확인하셨을 것 같기도.. cDNA에서 하실 때는 pfu가 좋은 것 같습니다. taq은 mutation 될 때가 만더라구요..하지만 일단 product를 얻으셨다면 taq으로 그것을 다시 amplify하셔서 양을 늘려보는 것도 좋을 것 같습니다. 그래서 blunt end와 ta cloning을 동시에 해보는 것이지요~ 가끔 mutaion 된 건... 다시 back mutation을...ㅡ.ㅡ;;; 오랜 동안 유전자 못 얻는 것 보다야 나을 것 같아요...(제가 하두 고생을 해서...) 행운을 빕니다