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일단 library 제조 과정에 대한 이해가 필요할 것 같습니다. Clontech 제품을 사용하신다면 회사 홈페이지에서 정보를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 expression vector에 cDNA library를 cloning을 하면 in-frame cloning이 될 확률이 1/6입니다. Clonetech의 경우 자사의 독창적인 재조합 핵산 기술을 이용하여 1/3의 확률인 yeast two-hybrid (Y2H) 용 library를 제조하여 판매하고 있습니다. 그리고 full-length일수도 있지만 partial fragment도 많습니다. ATG가 있다고 해서 반드시 starting codon으로 이해되지는 않습니다. internal ATG 일수도 있죠... 그러므로 sequencing 결과를 가지고 반드시 확인을 해야하는 것이 과연 in-frame cloning이 되어 있는지를 체크해야합니다. 이는 pACT2와 같은 prey vector의 MCS에서부터 target gene 서열시작지점까지 codon의 배열이 in-frame인지 아닌지를 확인하는 것을 말합니다. out-frame로 cloning이 되면 일반적으로 굉장히 빨리 stop codon이 나오게 됩니다. 그렇더라도 일부의 아미노산이 합성될 수 있기 때문에 transactivation domain뒤에 작은 사이즈의 단백질 혹은 펩타이드가 퓨전된 재조합 단백질이 만들어 집니다. 이러한 비정상적인 단백질이 bait와 결합해서 false-positive signal을 만드는 경우는 흔히 존재합니다. 그리고 종종 5'-UTR region이 translation되어 false-positive signal이 나오기도 합니다. Blast search에서 ATG를 반드시 찾을 이유도 없습니다. 행여 vector sequence가 조금 포함되더라도 blast search에서 크게 문제될 게 없습니다. 어차피 search 결과에서 match되는 sequence를 확인할 수 있으니까요... blast search 후에는 앞서 말했듯이 반드시 in-frame cloning인지 아닌지를 확인해야 합니다. >안녕하세요. >이번에도 실험하다 궁금한 점이 있어 이렇게 달려왔어요. > >다름이 아니라 제가 yeast two hybrid system을 이용해 screening을 하는데요. 현재 sequencing 의뢰해서 결과를 받은 상태입니다. >그런데 sequencing 결과가 좀 아리송해서요. >sequencing 의뢰하기 전에 enzyme cutting으로 vector/insert 확인하고 보냈는데도 결과가 제대로 안 나왔어요. > >대충 sequencing 결과를 말씀드리자면, 제대로 읽지 못하는 nucleotide가많았고 그리고 제대로 읽혔다고 하는 것도 enzyme site 다음에 20~30 bp 이후에 ATG가 있구요, ATG 뒤에 15개 nucleotide가 더 읽혀지고 바로 stop codon이 있어요. 뭐가 잘못된 건가요?? > >그리고 blast search를 할때 insert(screening 해서 얻은 clone)가 library vector에 insertion된 enzyme site 이후의 nucleotide를 이용해서 해야 하나요?? 아님 enzyme site 이후 ATG를 찾아서 ATG를 포함한 그 이후의 nucleotide를 긁어서 blast search 해야 하나요??? > >제가 알기론 cDNA library screeing을 해서 찾은 clone이 full gene 뿐만 아니라 partial도 존재한다고 들었는데 full gene이 아닌 경우, 즉 partial로 존재시에도 ATG를 포함하고 있나요??? > >제가 의미전달을 제대로 했는지 모르겠네요. >제 질문에 대한 속 시원한 답변을 듣고 싶어요~~ >가능하면 빠른 시일내에.... 그럼 부탁드립니다. > >요즘 날씨가 상당히 후텁지근한데 더위 조심하시구요, >음식도 조심하세요~~!!!! > >그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. > >