2006-11-03
org.kosen.entty.User@511d4f15
이현정(endeavor821)
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안녕하세요.
실험하다 의문점이 생겨서 글 남깁니다.
다름이 아니라 제가 pGEX vector를 사용해서 cloning을 하고 이를 protein expression해서 protein purification을 하는데요....
cloning한 clone의 sequce에는 이상이 없는데 GST fusion protein을 expression하여 purification 을 하면 GST만 발현되는데 이건 왜 이런건가요??
처음엔 cloning이 잘못된 줄 알고 다시 cloning을 하여 sequence를 Forward/ Reverse 양방향 다 확인했거든요...
그런데도 protein 발현이 안되네요...
이는 clone 자체에 문제가 있는게 아니라 induction에 문제가 있는 건가요? induction 조건만 달리 해주면 protein 발현이 될까요??
해결점을 찾고 싶습니다.
그럼 빠른 답변 기다릴게요....
- Protein induction
- GST fusion protein
- protein purification
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
전주홍님의 답변
2006-11-04- 0
일단 in-frame cloning을 체크하셨으리라 생각합니다. GST-fusion system을 하다보면 타깃단백질마다 조금씩 다르지만, cleaved product 혹은 premature-terminated product가 major product로 나오는 경우가 간혹 있습니다. 이를 경우 주로 Coomassie staining 상으로는 GST와 비슷한 위치에서 main band가 보입니다. 박테리아 안에서 단백질이 합성되면서 endogenous protease에 의한 잘려나갈 수도 있고 crude extract preparation 과정에서 proteolysis가 일어날 수도 있습니다. 박테리아를 lysis buffer나 sonicator로 깨지 않고 바로 PAGE용 sample buffer로 끓인 것과 비교해 보면 어느 정도 윤곽이 잡힐 수 있습니다. Preparation 과정 중에 생기는 proteolysis라면 protease inhibitor cocktail을 과량 사용하거나 cold room에서 실험을 진행하여 어느 정도 억제시킬 수 있으나 완벽하게 proteolysis를 control하기 어려운 면도 있습니다. 잘 해결이 안된다면 His-tag이나 MBP-tag system으로 바꿔보시는 것도 한가지 방법입니다. >안녕하세요. >실험하다 의문점이 생겨서 글 남깁니다. > >다름이 아니라 제가 pGEX vector를 사용해서 cloning을 하고 이를 protein expression해서 protein purification을 하는데요.... >cloning한 clone의 sequce에는 이상이 없는데 GST fusion protein을 expression하여 purification 을 하면 GST만 발현되는데 이건 왜 이런건가요?? > >처음엔 cloning이 잘못된 줄 알고 다시 cloning을 하여 sequence를 Forward/ Reverse 양방향 다 확인했거든요... >그런데도 protein 발현이 안되네요... > >이는 clone 자체에 문제가 있는게 아니라 induction에 문제가 있는 건가요? induction 조건만 달리 해주면 protein 발현이 될까요?? > >해결점을 찾고 싶습니다. >그럼 빠른 답변 기다릴게요.... > > > -
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강동완님의 답변
2006-11-07- 0
안녕하십니까? 단백질 정제는 확실하진 않지만 아미노산 정제에 관한 연구를 수행한 사람을 알려드리겠습니다. 삼전순약 중앙연구소 김성일 박사님 016-9899-5439 아마 결정화를 통한 정제로 박사학위를 하셔서 도움되리라 판단됩니다. >안녕하세요. >실험하다 의문점이 생겨서 글 남깁니다. > >다름이 아니라 제가 pGEX vector를 사용해서 cloning을 하고 이를 protein expression해서 protein purification을 하는데요.... >cloning한 clone의 sequce에는 이상이 없는데 GST fusion protein을 expression하여 purification 을 하면 GST만 발현되는데 이건 왜 이런건가요?? > >처음엔 cloning이 잘못된 줄 알고 다시 cloning을 하여 sequence를 Forward/ Reverse 양방향 다 확인했거든요... >그런데도 protein 발현이 안되네요... > >이는 clone 자체에 문제가 있는게 아니라 induction에 문제가 있는 건가요? induction 조건만 달리 해주면 protein 발현이 될까요?? > >해결점을 찾고 싶습니다. >그럼 빠른 답변 기다릴게요.... > > > -
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이정은님의 답변
2006-11-10- 0
안녕하세요 저는 에이티젠 단백질정제팀에서 근무하고 있는 이정은 이라고 합니다. 제 경험상 단백질 정제를 위해서 DNA sequencing 확인는 기본중에 기본이며 sequence가 완벽하게 맞는다 해서 꼭 발현이 되는건 아닙니다. 그건 아래분이 말씀하신걸 포함해서 단백질이 발현이 될때 일어나는 여러가지 변수때문이지요. 제생각에 발현을 유도하는 것보다 (한번 발현이 안되는 얘들은 발현시키기가 정말 힘듭니다.)tagging을 바꾸어 보시거나, 도메인을 잘라서 작업해도 되는거라면 그렇게 해보는 것도 괜찮은 방법입니다. 그냥 남들도 할수 있는 답변만 해드린것 같네요 실험 꼭 성공하시길 바라겠습니다. -
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김진홍님의 답변
2006-11-15- 0
단백질 특성상 inclusion body 형성으로 인해 lysate에 발현이 안되는 경우도 있고 위에 분 말씀처럼 poteolysis에 따른 문제 일 수도 있는데요 inclusion body 같은 경우에는 induction 온도를 낮게 함으로써 조금에 효과를 보게 되는 경우도 있습니다.. 보통 induction을 30도에서 하거나 22도 까지 낮추어서 시도해보는것도 한가지 방법입니다.. cloning이 쉬운것도 아니고 ㅎㅎ 최대한 시도는 해보셔야 할듯하네요 꼭 성공하세요 >안녕하세요. >실험하다 의문점이 생겨서 글 남깁니다. > >다름이 아니라 제가 pGEX vector를 사용해서 cloning을 하고 이를 protein expression해서 protein purification을 하는데요.... >cloning한 clone의 sequce에는 이상이 없는데 GST fusion protein을 expression하여 purification 을 하면 GST만 발현되는데 이건 왜 이런건가요?? > >처음엔 cloning이 잘못된 줄 알고 다시 cloning을 하여 sequence를 Forward/ Reverse 양방향 다 확인했거든요... >그런데도 protein 발현이 안되네요... > >이는 clone 자체에 문제가 있는게 아니라 induction에 문제가 있는 건가요? induction 조건만 달리 해주면 protein 발현이 될까요?? > >해결점을 찾고 싶습니다. >그럼 빠른 답변 기다릴게요.... > > >