2006-12-15
org.kosen.entty.User@28dd855e
신익재(ijbio)
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지난번에 올린 글인데 답변이 하도 없어서 다시 올립니다.
Histone protein중에 H2AX를 western blotting을 통해서 알아보려고 합니다.
논문에는 Acid extranction을 하여서 CAPS buffer를 이용해서 하면 된다고 하는데 아무리 해도 참고 논문처럼 나오지 않는군요.
논문에 NETS buffer라는 것으로 핵을 분리해서 0.1M HCl을 이용하여 핵속의 단백질을 분리했습니다.
근데 여기서 문제인 듯 싶은데 일반적으로 제가 웨스턴할 때 사용하는 샘플 버퍼(저는 4X)를 사용하는데 보통은 색깔이 파랗게 변하는데 이건 이상하게 노랗게 되면서 안에 이상한 덩어리같은 것이 생기더군요.
아무튼 참고 로딩하여 120V로 약 2시간 가량 내리고는 50mM CAPS transfer buffer (pH 10.0)을 이용하여 110V에서 1시간동안 transfer하였습니다. 근데 아무리해도 밴드가 이상하게 나오는군요. 게다가 논문에는 액틴을 붙여서 확인을 하였는데 저는 아무리해도 안되는군요.
혹시 아시는 분 계시면 방법 좀 알려주심 감사하겠습니다.
- 웨스턴
- H2AX
- Acid extranction
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
박태주님의 답변
2006-12-15- 0
전 H2AX웨스턴은 해 본적이 업습니다. 샘플 버퍼의 색깔은 pH indicator입니다. 색이 노랗게 바뀐다는 것은 추출과정에서 사용된 HCl때문에 샘플이 강한 산성을 띠는 것이라 생각됩니다. 샘플내의 pH가 문제가 될 수 도 있으니 1M Tris를 더 넣어서 적정 pH로 맞춰줘보시는 것도 한 방법일듯 합니다. >지난번에 올린 글인데 답변이 하도 없어서 다시 올립니다. > >Histone protein중에 H2AX를 western blotting을 통해서 알아보려고 합니다. >논문에는 Acid extranction을 하여서 CAPS buffer를 이용해서 하면 된다고 하는데 아무리 해도 참고 논문처럼 나오지 않는군요. >논문에 NETS buffer라는 것으로 핵을 분리해서 0.1M HCl을 이용하여 핵속의 단백질을 분리했습니다. > >근데 여기서 문제인 듯 싶은데 일반적으로 제가 웨스턴할 때 사용하는 샘플 버퍼(저는 4X)를 사용하는데 보통은 색깔이 파랗게 변하는데 이건 이상하게 노랗게 되면서 안에 이상한 덩어리같은 것이 생기더군요. >아무튼 참고 로딩하여 120V로 약 2시간 가량 내리고는 50mM CAPS transfer buffer (pH 10.0)을 이용하여 110V에서 1시간동안 transfer하였습니다. 근데 아무리해도 밴드가 이상하게 나오는군요. 게다가 논문에는 액틴을 붙여서 확인을 하였는데 저는 아무리해도 안되는군요. > >혹시 아시는 분 계시면 방법 좀 알려주심 감사하겠습니다. > >