2007-01-18
org.kosen.entty.User@653d5feb
신익재(ijbio)
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저는 단백질을 전기영동을 하여 웨스턴으로 확인하는 실험을 하는 중입니다.
근데 문제는 제가 가진 antibody가 total protein을 detection할 수 있는 antibody라는 것입니다. 아무리 찾아봐도 phosphorylation된 것을 찾을 수가 없습니다.
근데 논문에 보니 전기영동을 잘 하면 phosphorylation된 form은 정상적인 form보다 무겁기 때문에 전기영동을 하면 retardation이 되어서 밴드가 전기영동상에서 약간 위에 나타난다는데 아무리 실험을 해도 조건을 잡을 수가 없네요.
혹시 방법을 아시는 분은 도움을 주시면 감사하겠습니다.
참고로 제가 분리하려는 단백질의 사이즈는 204kDa이고 저는 나름대로 분리하기 위해서 7.5% 젤에서 80V로 10시간을 내려도 보고 9% 젤에서 100V로 12시간을 내려보았는데도 차이가 안나네요. 단지 하나 이상한 것은 약간 끌려서 나오는 밴드는 있지만 밴드가 아래 위 구분이 되는 것 같지는 않습니다.
그리고, 다시 한번 강조하지만 phosphorylation된 Ab는 시중에 없기 때문에 어쩔 수 없이 이 방법(전기영동상에서 위치 차이)을 사용하는 것이니 phosphorylation된 Ab를 사는 것이 좋겠다는 답변은 사양합니다.
그럼 수고하세요.
- electrophoresis
- phosphorylation
- western blotting
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
김홍기님의 답변
2007-01-18- 0
일단 단백질 사이즈가 상당히 커서 gel에서 band의 retardation을 관찰하기 힘들 것으로 예상됩니다. 제 생각엔 어떻게 실험하셨는지 모르지만, in vitro kinase assay를 하실 때 P32로 표지된 ATP를 함께 넣어주어 실험을 하고 PAGE-Western blot-film expose하시면 band의 retardation을 쉽게 관찰할 수 있을 겁니다. 단 target protein을 phospholyation을 시키는 kinase가 있어야 하구요... 그 이외에 PAGE한후 phospho-staining 하시는 것도 한 방법입니다. phosphate group을 염색할 수 있는 형광염색을 말하는 거구요... 단 형광 스캐너가 있어야 확인 가능합니다. 그럼 참고하세요 >저는 단백질을 전기영동을 하여 웨스턴으로 확인하는 실험을 하는 중입니다. > >근데 문제는 제가 가진 antibody가 total protein을 detection할 수 있는 antibody라는 것입니다. 아무리 찾아봐도 phosphorylation된 것을 찾을 수가 없습니다. > >근데 논문에 보니 전기영동을 잘 하면 phosphorylation된 form은 정상적인 form보다 무겁기 때문에 전기영동을 하면 retardation이 되어서 밴드가 전기영동상에서 약간 위에 나타난다는데 아무리 실험을 해도 조건을 잡을 수가 없네요. > >혹시 방법을 아시는 분은 도움을 주시면 감사하겠습니다. > >참고로 제가 분리하려는 단백질의 사이즈는 204kDa이고 저는 나름대로 분리하기 위해서 7.5% 젤에서 80V로 10시간을 내려도 보고 9% 젤에서 100V로 12시간을 내려보았는데도 차이가 안나네요. 단지 하나 이상한 것은 약간 끌려서 나오는 밴드는 있지만 밴드가 아래 위 구분이 되는 것 같지는 않습니다. > >그리고, 다시 한번 강조하지만 phosphorylation된 Ab는 시중에 없기 때문에 어쩔 수 없이 이 방법(전기영동상에서 위치 차이)을 사용하는 것이니 phosphorylation된 Ab를 사는 것이 좋겠다는 답변은 사양합니다. > >그럼 수고하세요. > > -
답변
박재봉님의 답변
2007-01-19- 0
>저는 단백질을 전기영동을 하여 웨스턴으로 확인하는 실험을 하는 중입니다. > >근데 문제는 제가 가진 antibody가 total protein을 detection할 수 있는 antibody라는 것입니다. 아무리 찾아봐도 phosphorylation된 것을 찾을 수가 없습니다. > >근데 논문에 보니 전기영동을 잘 하면 phosphorylation된 form은 정상적인 form보다 무겁기 때문에 전기영동을 하면 retardation이 되어서 밴드가 전기영동상에서 약간 위에 나타난다는데 아무리 실험을 해도 조건을 잡을 수가 없네요. > >혹시 방법을 아시는 분은 도움을 주시면 감사하겠습니다. > >참고로 제가 분리하려는 단백질의 사이즈는 204kDa이고 저는 나름대로 분리하기 위해서 7.5% 젤에서 80V로 10시간을 내려도 보고 9% 젤에서 100V로 12시간을 내려보았는데도 차이가 안나네요. 단지 하나 이상한 것은 약간 끌려서 나오는 밴드는 있지만 밴드가 아래 위 구분이 되는 것 같지는 않습니다. > >그리고, 다시 한번 강조하지만 phosphorylation된 Ab는 시중에 없기 때문에 어쩔 수 없이 이 방법(전기영동상에서 위치 차이)을 사용하는 것이니 phosphorylation된 Ab를 사는 것이 좋겠다는 답변은 사양합니다. > >그럼 수고하세요. 일단 단백질이 커서 쉽지 않을 듯합니다. 2차 전기영동방법중 isoelectrofocusing을 하시면 인산기가 붙어있는 단백질의 경우는 pI값이 달라져 일단 분리가 될 것 같으며 2차 전기 영동후 western blot을 하시면 될 것 같습니다. 우선 인산화여부만 알면 되니까 mini-two D gel (Bio-Rad) kit를 사용하시면 될 것 같습니다. > > -
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양수진님의 답변
2007-01-19- 0
분리하려는 단백질의 molecular weight이 정확하고, marker를 가지고 계시다면 Pierce Biotechnology의 GelCode Phosphoprotein Staining Kit를 사용해보실 수도 있을 겁니다. 전기영동 후 gel을 그대로 staining하시면 되며 육안으로 확인이 가능합니다. 이 staining kit의 sensitivity는 ng 수준이고, phosphoprotein을 detection하려는 경우 phosphorylation 정도가 낮은 경우가 많으므로 loading하려는 샘플에 일정양 이상의 분리하려는 단백질이 있어야 합니다. 또한, phosphorylation이 여러 아미노산 잔기에서 일어나고, 각각의 다른 아미노산 잔기에서의 phosphorylation이 다른 기능을 가지거나 혹은 특정 아미노산 잔기 (serine, tyrosine, etc.)에서만 phosphorylation된 단백질을 분리하려고 한다면 이 방법은 사용하실 수 없습니다. 또한 단지 phosphorylation의 여부 차이로 retardation된 band는 찾기 어렵습니다. 다량의 total protein을 loading할 경우 overlap되기 쉽고, overlap을 막기 위해 소량의 total protein을 loading할 경우 phosphorylation protein을 fraction의 양이 너무 적어 detection이 안 될 수도 있습니다. 다른 분이 제안한 방법 혹은 또 다른 방법을 찾는 것이 나을 것 같습니다.