2007-05-30
org.kosen.entty.User@4a19f1aa
양경미(yakm)
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retrovirus 실험을 하고 계신 분의 조언 바람니다.
retrovirus generation을 위해 our gene insertion in pBABE과 pVSVG를 GP2-293에 co-transfection할때의 condition에 관한 질문입니다.
GP2-293은 은 매우 weak하여 transfection시 매우 까다로운것 같습니다.
제가 했던 실험 조건은
- cell density : about 70%
- DNA양 : 각각 5ug(1 : 1)/60mm dish,
- lipofectamin 2000으로 transfection
- infection후 5시간 후 media change(DMEM)
: 문제점-GP2-293 cell의 mophology가 바뀜(좀더 가는 모양으로..)
- 48hr동안 virus generation
: 문제점 - 48시간 후에는 Media의 color가 거의 노란색에 가까움)
그럼에도 불구하고, harvest 된 virus solution을 293cell에 infection하면 293 cell의 모양이 바뀜-cell의 바깥부분이 가늘에 변함
무슨 문제일까요? 이 분야를 하시는 분이 계시면 조언바람니다.
- retrovirus
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
김동욱님의 답변
2007-06-04- 0
>retrovirus 실험을 하고 계신 분의 조언 바람니다. >retrovirus generation을 위해 our gene insertion in pBABE과 pVSVG를 GP2-293에 co-transfection할때의 condition에 관한 질문입니다. >GP2-293은 은 매우 weak하여 transfection시 매우 까다로운것 같습니다. >제가 했던 실험 조건은 >- cell density : about 70% >- DNA양 : 각각 5ug(1 : 1)/60mm dish, >- lipofectamin 2000으로 transfection >- infection후 5시간 후 media change(DMEM) > : 문제점-GP2-293 cell의 mophology가 바뀜(좀더 가는 모양으로..) >- 48hr동안 virus generation > : 문제점 - 48시간 후에는 Media의 color가 거의 노란색에 가까움) > >그럼에도 불구하고, harvest 된 virus solution을 293cell에 infection하면 293 cell의 모양이 바뀜-cell의 바깥부분이 가늘에 변함 > >무슨 문제일까요? 이 분야를 하시는 분이 계시면 조언바람니다. > > Insert DNA가 무었인지요. 만일 cell morphogenesis를 조절하는걸 삽입한건아닌지요? 실험조건은 별이상 없어 보입니다. 통상 293에 다량의 virus를 infection하면 많은 cell이 동그랗게 나오지만, 적절하게 infection하면 정상적인 모양과 구별안됩니다. 만일 궁금하면 vector contolr을 infection해보길 권합니다. vector control도 그러하다면 293에 바이러스양을 줄여서 infection해보십시요. 3년전에 제가 썼던 시스템에서는 vector contorl에 GFP가 있어서 대략적인 virus titer도 계산하고 infection된 cell모양도 관찰하는데 유용했습니다. 만일 계속 그래서 찜찜하면 virus를 harvest한후 약 500 ul PBS에 다시 녹인후 infection 해보십시요. 만일 그래도 문제가 있다면 293가 건강하지 않아서 그럴수 있으니 HeLe에 infection해보세요. 그래도......맘에 안들면 lentivirus system(invitrogene)을 권합니다.(첨부파일참조 자세한것 homepage를 참조바랍니다.)