2007-05-31
org.kosen.entty.User@159b81b2
박세아(ssehaa)
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1) 먼저 RNA를 뽑을 때 마지막 washing을
75% ethanol로 해주는데 이것이
완전히 제거되지 않았을때
RT가 되지 않는지!
2) 이미 만들어진 RT product가 4도씨 온도에서
3일동안 두었었는데,
cDNA가 합성되지 않아서
혹시나 해서 Reverse transcriptase 만 다시 넣고
돌려 볼까 하는데
이게 가능할까요?
미련이 남아서 버리질 못하겠네요ㅠㅠ
- PCR
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답변 2
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답변
김형준님의 답변
2007-05-31- 0
>1) 먼저 RNA를 뽑을 때 마지막 washing을 >75% ethanol로 해주는데 이것이 >완전히 제거되지 않았을때 >RT가 되지 않는지! > >2) 이미 만들어진 RT product가 4도씨 온도에서 >3일동안 두었었는데, >cDNA가 합성되지 않아서 >혹시나 해서 Reverse transcriptase 만 다시 넣고 >돌려 볼까 하는데 >이게 가능할까요? >미련이 남아서 버리질 못하겠네요ㅠㅠ > > 답변: 마지막단계에서 Washing을 한뒤 Dry하는 것이 중요합니다. 또한 현재문제점에 앞서서 RNA를 Pure하게 뽑아 냈는지 Gel을 만들어서 확인 하시는 것이 좋겠구요 필요하다면 UV Spec을 이용하여 RNA의 농도를 계산해 보시는 것도 좋겠습니다. 이렇게 확인이 끝나시면 RNA를 제대로 뽑았다고 할 수 있고요 cDNA을 합성하시기 위해 Reverse transcription을 위한 준비작업에서 Total RNA에 사용 될 Primer 와 Buffer등을 잘 확인하시고 해보세요. 가장 중요한 것은 RNA를 제대로 뽑아냈는지 확인을 하시는 것이 중요합니다. -
답변
허광래님의 답변
2007-06-01- 0
>1) 먼저 RNA를 뽑을 때 마지막 washing을 >75% ethanol로 해주는데 이것이 >완전히 제거되지 않았을때 >RT가 되지 않는지! > >2) 이미 만들어진 RT product가 4도씨 온도에서 >3일동안 두었었는데, >cDNA가 합성되지 않아서 >혹시나 해서 Reverse transcriptase 만 다시 넣고 >돌려 볼까 하는데 >이게 가능할까요? >미련이 남아서 버리질 못하겠네요ㅠㅠ > > 1) Ethanol wash가 문제되는 경우 거의 없습니다. 살짝만 말려도 문제없습니다. 너무 오래 말리면 다시 녹이느라 힘만 듭니다. 2) cDNA 합성이 안되었다면 십중팔구 RNA가 안 좋은것입니다. 가) RNA 품질 확인 지방질이나 RNase가 많은 동물세포나 세포벽이 단단한 식물세포 혹은 효모세포들은 RNA 뽑기 힘듭니다. 또한 잘 못 뽑으면 spec 값은 많이 나오지만 실제로는 RNA가 없습니다. 그러므로 정량은 아무리 RNA가 아까워도 꼭 젤을 걸어보아서 눈으로 확인해야 합니다. 이때 18S와 28S의 비율이 1:2가 맞지 않으면 이것도 이상한 징조입니다 (가끔 젤을 만들때 젤에 EtBR을 넣어주지 않고 나중에 염색하면 염색이 늦어서 이런 경우가 있음). 나) 정량 아가로즈 젤로 정량하는 것은 정말 어려운 일입니다. EtBr이 첨가된 아가로오즈를 1% 정도되게 페트리 디쉬에 부은 후에, 10 pg 단위 (약 1 ul volume)로 젤에 찍어서 UV로 확인하고 대조 RNA와 비교하여 정량하면 됨. 하지만 이 방법은 젤을 먼저 걸어서 품질 확인이 된 후에 사용하여야 합니다. 안 그러면 DNA와 뽀개진 RNA 조각도 같이 염색되므로.. 3) cDNA가 안 만들어 졌으면 미련없이 RNA추출부터 다시 하십시요. 4)또한 cDNA 만들어진 후에 젤 elution한다고 short wave UV 쬐면 지금까지 잘한 일의 반은 말아먹는 거니 조심하십시요. 반드시 long wave 사용하세요. 2)번이 잘 되었으면 그 다음은 젤 대신 컬럼을 걸어서 해도 되고 탄탄대로입니다. ^^ 이상까지는 RNA와 cDNA에서는 자신있는 제 경험입니다.