2007-06-06
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진언호(jinunho)
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안녕하세요.
돼지 세포에 human serum을 넣어 cytotoxicity를 측정하고 있습니다.
첨엔 파는 제품을 사서 처리 했더니 아무 반응이 없어 주위 분의 양해를 구해 병원에서 10 ml 혈액을 분리, 원심 분리 후 37에서 굳히고 다시 vortex해서 침천물 제거 후 사용하니 돼지 세포가 아주 잘 죽었습니다. 그래서 이번엔 다시 5 명으로부터 20 ml씩 혈액을 얻어 같은 방법으로 했는데 잘 죽지 않습니다. 물론 어느 정도의 cytotoxicity는 나오는데 전보다, 예상보다 훨씬 안되네요. antibody, complement 등을 잘 보존하며 국지 37도 incubation에 굳지 않는 혈장을 어떻게 준비하는지 상세히 가르쳐 주시면 감사드리겠습니다. 아님 좋은 회사 제품이라도... 경험있는 분의 도움 부탁드립니다.
- human serum
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답변 6
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민경진님의 답변
2007-06-06- 0
1. 2.5 % dextran (in PBS)과 혈액을 1 (blood):4(dextran)로 섞어서 45분 incubation. (In RT) --> 이렇게 하면 Dextran과 적혈구가 binding하여 침전 2. 7.5 ml 의 ficoll 에 약 17.5 ml 의 혈장 부분(적혈구만 빠진 혈액)을 ficoll과 섞이지 않게 천천히 잘 넣어준다. (이때 ficoll과 안섞이는 것이 중요) 3. swing-bucket centrifuge, 400g X 30 min 4. 아래서부터 RBC+neutrophil/Ficoll/monocyte+lymphocyte/혈장 순으로 분리된다. --> 이렇게 분리된 혈장을 쓰시면 안될까요? >안녕하세요. >돼지 세포에 human serum을 넣어 cytotoxicity를 측정하고 있습니다. >첨엔 파는 제품을 사서 처리 했더니 아무 반응이 없어 주위 분의 양해를 구해 병원에서 10 ml 혈액을 분리, 원심 분리 후 37에서 굳히고 다시 vortex해서 침천물 제거 후 사용하니 돼지 세포가 아주 잘 죽었습니다. 그래서 이번엔 다시 5 명으로부터 20 ml씩 혈액을 얻어 같은 방법으로 했는데 잘 죽지 않습니다. 물론 어느 정도의 cytotoxicity는 나오는데 전보다, 예상보다 훨씬 안되네요. antibody, complement 등을 잘 보존하며 국지 37도 incubation에 굳지 않는 혈장을 어떻게 준비하는지 상세히 가르쳐 주시면 감사드리겠습니다. 아님 좋은 회사 제품이라도... 경험있는 분의 도움 부탁드립니다. -
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진언호님의 답변
2007-06-07- 0
satang97 답변 감사드립니다. dextran은 일반적으로 판매하는 것 (분자량 상관없이 섞인)으로 쓰면 되죠? 그리고 Ficoll은 저희가 가진 게 Mw. 400,000인데 몇 %로 사용해야 하나요? 실험해 보겠습니다. 감사드립니다. -
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진언호님의 답변
2007-06-09- 0
명쾌한 답변 감사드립니다. 논문을 아무리 찾아봐도 방법을 적어둔 곳이 없어서 임상관리사분께 문의를 했더니 37도에서 1-2 시간 두면 피브리노겐이 엉킨다고 해서 해봤죠. 안그래도 IgGsk complement가 상하지 않을까 걱정이었는데. 첨엔 재수 좋아 성공했던 것 같습니다. 님의 지적대로 혈청을 분리하려는 의도가 맞습니다. 냉장에서 overnigt해서 원심분리 후 37도로 이종세포에 처리하면 다시 굳거나 하진 않나요? 전엔 3 시간 후 원심 분리해서 37도에 처리하니 다시 굳어버려서 문제가 됐었는데. 혹 좀 더 충고해 주고 싶은 내용이 있으면 어떤 내용이라도 좋으니 도움 부탁드리겠습니다. 감사합니다. -
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박세아님의 답변
2007-06-09- 0
>안녕하세요. >돼지 세포에 human serum을 넣어 cytotoxicity를 측정하고 있습니다. >첨엔 파는 제품을 사서 처리 했더니 아무 반응이 없어 주위 분의 양해를 구해 병원에서 10 ml 혈액을 분리, 원심 분리 후 37에서 굳히고 다시 vortex해서 침천물 제거 후 사용하니 돼지 세포가 아주 잘 죽었습니다. 그래서 이번엔 다시 5 명으로부터 20 ml씩 혈액을 얻어 같은 방법으로 했는데 잘 죽지 않습니다. 물론 어느 정도의 cytotoxicity는 나오는데 전보다, 예상보다 훨씬 안되네요. antibody, complement 등을 잘 보존하며 국지 37도 incubation에 굳지 않는 혈장을 어떻게 준비하는지 상세히 가르쳐 주시면 감사드리겠습니다. 아님 좋은 회사 제품이라도... 경험있는 분의 도움 부탁드립니다. human serum 이라고 하면 혈장(plasma)이 아닌 '혈청'이라고 합니다. 혈장에서 혈액 응고인자 피브리노겐(fibrinogen)이 제거된 형태입니다. 혈장을 분리하시려는 건지, 혈청을 분리하시려는 건지 모르겠네요 혈장은 혈액을 뽑을 때 헤파린이라는 혈액 응고를 억제하는 물질을 넣어 혈액 응고를 방해한 후에 원심분리를 돌리면 혈장이 되고 혈청은 헤파린을 넣지 않고 순수한 혈액을 4도씨에서 하루 정도 냉장고에 두시면 피브리노겐이 가라앉아 굳게되고 이것을 원심분리하여 사용하면 혈청이 됩니다. 피브리노겐이 잘 가라 앉도록 하는데는 이렇게 냉장고에 좀 긴시간 방치하거나 실온에서 두기도 합니다. 37도시 방치는 들어보지 못했는데 혹 이 온도에서 혈청? 혈장안에서의 물질 변성이 일어날 수 도 있을 것 같습니다. Ficoll의 사용은 혈청 또는 혈장의 분리 보다는 백혈구 층 (monocyte가 첨가된)의 분리를 위해 주로 사용합니다. 원심분리를 통해서도 혈장 혈청의 분리는 잘 되므로.. protocol의 확립을 위해서라도 확실한 논문을 참고하시는 것이 나을 듯 하네요 그럼, 도움이 되셨길 바랍니다 -
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박세아님의 답변
2007-06-11- 0
>안녕하세요. >돼지 세포에 human serum을 넣어 cytotoxicity를 측정하고 있습니다. >첨엔 파는 제품을 사서 처리 했더니 아무 반응이 없어 주위 분의 양해를 구해 병원에서 10 ml 혈액을 분리, 원심 분리 후 37에서 굳히고 다시 vortex해서 침천물 제거 후 사용하니 돼지 세포가 아주 잘 죽었습니다. 그래서 이번엔 다시 5 명으로부터 20 ml씩 혈액을 얻어 같은 방법으로 했는데 잘 죽지 않습니다. 물론 어느 정도의 cytotoxicity는 나오는데 전보다, 예상보다 훨씬 안되네요. antibody, complement 등을 잘 보존하며 국지 37도 incubation에 굳지 않는 혈장을 어떻게 준비하는지 상세히 가르쳐 주시면 감사드리겠습니다. 아님 좋은 회사 제품이라도... 경험있는 분의 도움 부탁드립니다. 저의 랩에서도 serum을 분리하여 사용하고 있으나 37도씨에서 굳지 않습니다. BD회사에서 나온 reference를 첨부합니다. hemolysis에 대한 내용이며 제일 마지막에 full clotting을 위해 30분 방치해야 하며, clot activator를 제거하기 위해서는 1시간 방치해야 한다고 나옵니다. 저의 랩에서도 이렇게 실온 또는 냉장방치 후 사용합니다. 그럼 도움이 되셨길 바랍니다. -
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진언호님의 답변
2007-06-11- 0
감사