2007-09-21
org.kosen.entty.User@501c72c8
선종흠(humi09)
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얼마전에 질문 올렸는데 또 궁금한것이 있어서~ㅎ
제가 실험을 하면서 원래의 프로토콜에서 방법을 약간 바꿨습니다.
우선 원래 프로토콜은..
1) B16F1 Cell을 10%FBS DMEM 배지로 37℃ 5% Co2 Incubator 배양 유지 한다.
2) 시험을 위하여 일정한 수의 세포(1X10개)를 6well Plate 에 배양하여 세포의
부착을 확인한 후, 세포배양액에 일정한 농도의 샘플을 처리 하여 2~3일
동안 배양 한다.
* MTT Assay 후에 독성을 확인하여 농도를 결정 한다.
* 희석하여 Sampling ( 1/20, 1/10, 등으로 희석)
3) 배양액을 제거한 후 PBS1X 로 세척하고 T/E or Cell Scraper 이용하여
세포를 수확한다.
4) 2500rpm 5min 원심분리 하여 세포의 pellet을 얻은 후 색깔을 확인하고
1N NaOH 100ul 에 녹이고 37℃ Incubator에서 Overnight 한다.
* 1N NaOH 200ul + DMSO 100ul + D.W 700ul = Total 1ml
5) Overnight 후에 475nm에서 흡광도 측정한다.
6) Melanin Standard 에 대입하여 멜라닌 양을 계산하고 멜라닌 세포의
Total Protein 양 또는 세포수로 값을 보정하여 Protein 당 Melanin양
으로 표시 한다.
여기서 4번과정을
10% DMSO 가 포함된1N NaOH 를 넣고 60도에서 1시간 incubation 시킨 후 96 well-plate에 옮겨서 490nm 에서 흡광도 측정.
흡광도를 측정 해봤는데 콘트롤과 처리구의 값이 너무 낮고 별 차이가
안나서 475nm 에서 찍어 봤는데 콘트롤과 처리구의 흡광도값이 유효하게 나왔습니다
흡광도 결과 입니다. 엘라이저로 측정 한것입니다.
490nm 콘트롤 : 0.06
처리구 : 0.02
475nm 콘트롤 : 0.603
처리구 : 0.297
490nm 에서 475nm 바꿔서 측정해도 무방한가요??
- 멜라닌
- 저해
- 흡광도
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
장성재님의 답변
2007-09-22- 0
>흡광도 결과 입니다. 엘라이저로 측정 한것입니다. > >490nm 콘트롤 : 0.06 >처리구 : 0.02 > >475nm 콘트롤 : 0.603 >처리구 : 0.297 > > >490nm 에서 475nm 바꿔서 측정해도 무방한가요?? 우선 죄송합니다. 저널 몇편만을 찾아보고 답변을 드렸었는데 제가 찾아본 저널에는 대개 ELISA reader에서 주로 사용하는 파장인 405nm에서 측정하는 방법을 주로 사용하고 있었습니다. 일단 식약청의 가이드 라인이 있다면 그것에 준해서 실험을 하실 것을 추천합니다. 하지만 제가 생각하기에 가이드 라인은 아직 표준화 되지 않은 단지 관련 연구자들이 모여서 연구회를 만들어 그 중 엄선된 실험법일 뿐 표준시험법은 아닐 것으로 생각이 되는군요. 그러나 위의 데이터를 봤을 때 490nm에서의 흡광도에서의 결과치와 475nm의 결과치가 상당한 차이를 보이는 것과 490nm에서의 콘트롤치인 0.06과 처리구의 0.02의 차이로 실험결과를 분석한다는 것은 무리가 있어 보이네요. 제가 살펴본 또 다른 일본 그룹의 데이타 (Biological & Pharmaceutical Bulletin, Vol.27 (2004), No. 4, p510)에서는 470nm에서의 결과를 사용한 것도 있더군요. 콘트롤로 사용하시는 표준품인 melanin을 용매에 녹이신 후 흡광도 스펙트럼을 직접 한번 조사하시고, 사용하시는 세포의 경우도 용매에 녹이신 후 스펙트럼을 한번 조사해 보시길 권장합니다. 멜라닌 흡광 스펙트럼 http://www.cl.cam.ac.uk/~jgd1000/melanin.html http://www.azom.com/details.asp?ArticleID=3048 멜라닌의 산화도 등에 의해서도 흡광 스펙트럼에는 상당한 차이가 발생하는 군요. 참고가 되시길.... 끝으로 실험법을 자신이 이론적으로 타당한 이유를 토대로 바꾸고 개발, 변형해 나가는 것이 진정한 연구라고 할 수 있지 않은지요. 건투를 빕니다. -
답변
선종흠님의 답변
2007-09-22- 0
우선 답변 감사합니다. 그런데 475nm 에서 흡광도를 보라고 한것은 화장품 업계에서 시험 하시는분이 알려주신것 입니다. 실험 프로토콜 역시 그분이 시험할때 하는 프로토콜 이구요. 490nm 역시 멜라닌 실험을 하셨던 분께서 알려주신 것 입니다. 님 께서 보내주신 자료를 보긴 봤었는데.. 아무래도 실험을 하셨던 분들이 알려주신걸로 하다보니~ㅎ 그리고 아마 이 실험을 안하셔서 그런가 본데 식약청 가이드라인 미백실험법에도 490nm 에서 측정하라고 되어있습니다. 405nm가 일반적인것이 아니죠.ㅎ -
답변
선종흠님의 답변
2007-09-23- 0
우선 많은 자료 감사합니다. 근데 식약청 가이드라인대로 490nm 에서 흡광도를 찍어보면 값이 라고 할수 없는 데이터가 나와서., 실험과정에서 세포의 펠렛 색을 확인해보면 컨트롤과 처리구의 색이 확연히 차이가 납니다. 콘트롤 검고 처리구는 셀이 하얗게 변해있죠. 그렇다면 멜라닌 저해를 많이 시켰다는 것이죠. 원래 세포의 색이 검으니까 말이죠. 그런데 490nm 에서 찍어보면 값은 너무 낮게 나와서 이상하여 475nm 로 찍어보니 펠렛의 색과 비슷한 값이 나온것 입니다.ㅎ그래서 475nm로 계속 실험을 할 예정입니다.^^ 추석연휴 인데도 답변을 해주시고 많은 도움을 주셔서 감사합니다.ㅎ 제가 연구생활을 한지 얼마 되지 않아서 아직 조금은 부족 합니다.ㅎ 혼자서 다 할려고 하다보니 막히는 부분이 많네요~ 실험실 선배가 있는것도 아니고~ㅎ 귀하가 하시는 연구도 건승 하길 바랍니다.ㅎ