2008-02-19
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최미희(rainbow14)
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vector는 pET-28a를 사용하고, 약 1.2Kb되는 insert DNA를 ligation하는데
도통 되질 안아요~
처음에는 transformation했을때 colony라도 뜨던데 ..
그 이후로는 전혀 안되네요..
insert만 gelt상에서 확인하면 밴드가 제대로 나오는데요
PCR만 하면 약 500bp상에서 밴드가 나와요..
어디서 잘못 된건지 잘 모르겠습니다.
Kit도 바꿔서 사용해봤는데 ligase를 조금 늦게 넣는 방법도 해봤거든요..
고수님들 좋은 경험담이나 노하우 부탁드립니다.
- ligation
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답변 2
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답변
박현님의 답변
2008-02-20- 0
정확한 실험 방법들이 없어서 정확한 답변이 어려울것 같네요.. 먼저 insert DNA가 정말 원하는 것이 맞는지 확인을 해 보는건 어떨까요? gel상 band의 위치로 맞는다고 해서 모두 맞는건 아니니까요.. 그리고 colony 가 나타나지 않는다고 했는데.. 제 생각은 insert DNA의 self ligation이 된거 같은데.. 그럼 vector와 insert DNA의 비율을 조절해서 ligation해보는 것이 어떨지.. 명확한 답변이 아니라서 죄송하고요.. 조금이라도 도움이 되었음 좋겠네요.. >vector는 pET-28a를 사용하고, 약 1.2Kb되는 insert DNA를 ligation하는데 >도통 되질 안아요~ >처음에는 transformation했을때 colony라도 뜨던데 .. >그 이후로는 전혀 안되네요.. >insert만 gelt상에서 확인하면 밴드가 제대로 나오는데요 >PCR만 하면 약 500bp상에서 밴드가 나와요.. >어디서 잘못 된건지 잘 모르겠습니다. >Kit도 바꿔서 사용해봤는데 ligase를 조금 늦게 넣는 방법도 해봤거든요.. >고수님들 좋은 경험담이나 노하우 부탁드립니다. -
답변
안선영님의 답변
2008-02-20- 0
혹시 주위에서 500bp의 DNA를 쓰시는 분이 없으신지 찾아보시고요 그런분이 있으시다면 전부 다 시약이나 primer를 다시 쓰셔야할듯 하고요.. 그렇지가 않다면 CP cell을 계대배양 여러번 하신후 만드셔서 써보세요.. 그리고 vector와 insert의 비율은 3:1로 넣으시면 좋은거 같더라고요.. 그 공식은 구글에서 찾아보시면 나올겁니다..