2008-03-31
org.kosen.entty.User@44780080
안성민(yakmopai)
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p-akt (ser473, cat. 9271s)를 구입해서 웨스턴을 하는데..blocking이 안되요..ㅠ_ㅠ
제품 데이타싯을 보고 skim milk로 5~8%해보기도 하고, BSA 3~8%도 해보았는데
계속 잡밴드가 심하게 생기네요..ㅜ_ㅜ (4도씨 12시간)
물론 샘플에는 phosphatase inhibitor를 처리했구요..샘플양은 10ug이에요
혹시 해보신 분들중에 사용하셨던 조건이 있으신지요..?
부탁드립니다..ㅜ_ㅜ
- phospho-akt
- western blot
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답변 2
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답변
김현선님의 답변
2008-04-01- 0
>p-akt (ser473, cat. 9271s)를 구입해서 웨스턴을 하는데..blocking이 안되요..ㅠ_ㅠ > >제품 데이타싯을 보고 skim milk로 5~8%해보기도 하고, BSA 3~8%도 해보았는데 >계속 잡밴드가 심하게 생기네요..ㅜ_ㅜ (4도씨 12시간) > >물론 샘플에는 phosphatase inhibitor를 처리했구요..샘플양은 10ug이에요 > >혹시 해보신 분들중에 사용하셨던 조건이 있으신지요..? > >부탁드립니다..ㅜ_ㅜ > > 잡밴드가 뜨는 경우는 2차 항체때문인 경우가 많습니다. 1차가 poly거나 Rabbit 일 경우 심할 수 도 있구요 다음과 같은 제안을 해봅니다. 1. 2차항체 농도를 낮춰보세요. 2. 2차 붙이기 전에 blocking 10분 해보세요 3. 2차항체를 skim milk에서 희석하여 반응 시키세요. 4. 반응시간은 30분 안으로 해보세요. -
답변
옥민호님의 답변
2008-04-01- 0
>p-akt (ser473, cat. 9271s)를 구입해서 웨스턴을 하는데..blocking이 안되요..ㅠ_ㅠ > >제품 데이타싯을 보고 skim milk로 5~8%해보기도 하고, BSA 3~8%도 해보았는데 >계속 잡밴드가 심하게 생기네요..ㅜ_ㅜ (4도씨 12시간) > >물론 샘플에는 phosphatase inhibitor를 처리했구요..샘플양은 10ug이에요 > >혹시 해보신 분들중에 사용하셨던 조건이 있으신지요..? > >부탁드립니다..ㅜ_ㅜ > > 먼저, 그 Ab 제공사에서 추천한 buffer를 사용하세요. 특히 TBS-T 0.1 % 에 BSA 로 blocking 을 해 주시고, 정확한 상황은 모르지만, 잡밴드가 많이 나온다면, 1nd Ab의 농도를 1:1000 보다는, 1:5,000 - 1:10,000 으로 낮춰 주시고, 2nd Ab 의 농도를 아주 많이 낮추시고 (100,000:1 - 600,000:1), ECL 등의 반응 시간을 조절해 주세요. 좋은 결과 얻으시길 바래요~