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>안녕하세요~ ^^ >Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다. >제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~ >시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 을 사용해두 무방할거 같습니다. Method중 turbidimetric법을 사용해서 pancreatic lipase activity 결정에 사용되는 방법들은 상대적으로 복잡한 편입니다. 그리고 비특이적이고 sensitivity가 낮다고 합니다. 그래서 Human Pancreatic Lipase ELISA Kit을 사용하기도 하는데 상업적으로 판매되는 모 제품중에서 sensitivity가 높으면서 특이적인 assay법으로 ELIZA plate에 코팅된 solid phase antibody와 HRP-conjuagated antibody에 의해 모두 특이적으로 인지되는 kit이 있습니다. 참고적으로 이 assay procedure를 첨가합니다. Step 1.Pipet 25 ul of standards, control, and serum samples into antibody coated wells. Add 100 ul-diluted Ab conjugate into each wells. Cover the plate and incubate at room temp for 30 min with gentle shaking. Step 2. Aspirate and wash the plate 5 times with water. Step 3. Add 100 ul of HRP substrate Solution A and 100 ul of HRP substrate Solution B into each well. Mix gently, cover the wells, and incubate at room temperature for 10 min to develop blue color. Step 4. Pipet 50 ul of stop solution into each wells and mix gently (blue color turns yellow). Measure absorbance at 450 nm.

>안녕하세요~ ^^ >Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다. >제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~ >시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ 전 serum이나 biological sample를 사용하는것이 아니라 버섯추출물 sample를 이용해 inhibition Pancreatic lipase activity실험을 하는것이기에 이 Human Pancreatic Lipase ELISA Kit와는 상관이 없을거라 생각됩니다..ㅜ_;; 죄송하지만 human pancreatic lipase를 사용한 험에 대한 자세한 method를 알았으면 합니다.

>안녕하세요~ ^^ >Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다. >제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~ >시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ Human pancreatic lipase(HPL)를 사용해도 무방할거 같습니다. 최근까지 HPL의 새로운 inhibitor의 보고가 꾸준히 되고 있습니다. 그중에서 가장 잘 알려진 inhibitor로는 화학적으로 합성한 tetrahydrolipstatin입니다. 물론 버섯에서 추출한 특정 성분의 물리화학적 성질이 어떤지는 모르겠지만 소수성과 친수성에 따라서 녹이는 용매만 잘 선택하면 될 것입니다. 제가 소개해 드릴 것은 소수성 성질이 있는 inhibitor를 사용했을때로 한정해서 설명드리면, 우선 control 실험은, HPL activity가 triolein을 기질로 사용해서 assay할 수 있습니다. 이때 보통 HPL의 양은 2mM Tris-HCl(pH7.0) buffer가 total volumn 1.5 ml에 0.1~0.5 pg(실험에 따라서 조절이 가능함 수 ng에서 수십 ng까지)을 사용하며, 기질은 수~수십 mg까지(~40mg/ml)을 첨가하면 됩니다. 이때 control을 위한 assay 대상은 방출된 fatty acid의 양을 pH meter로 측정하면 됩니다. (즉 효소반응에 따라서 방출된 지방산때문에 pH가 떨어지는 것을 측정함). 저해효과를 측정하기 위해서는 저해제로 테스트하기 위한 물질을 5-20배의 molar excess로 해서 HPL과 incubation하면 됩니다. 이때 저해제는 용해도에 따라서 적절한 유기용매를 선택하면 됩니다. 가능하면 분리하신 물질이 dimethylsulfoxide에 녹으면 이 용매를 선택하시기 바랍니다. 만약에 DMSO에 녹는다면 이 저해제 용액을 HPL incubation 버퍼(0.1 M Tris-HCl,pH 8.0)와 mixing하면 됩니다. 반응용액에서 시간에 따른 aliquot를 덜어내서 측정하는데, assay는 위에서 설명한 방출된 free fatty acid의 pH 감소 변화량 측정이나 방출된 glycerol(glycerol에 대한 enzymatic assay)의 control에 대한 감소율을 측정하면 될 것으로 생각됩니다. 저해률은 저해제를 첨가하지 않았을때 incubated된 cotrol sample의 활성의 퍼센트로서 계산하시면 됩니다. 남아 있는 활성의 자연로그 대 시간 또는 rate contants로 그래프를 그리면 될 거 같습니다. 참고할 만한 논문은 Q Lüthi-Peng and F K Winkler , Large spectral changes accompany the conformational transition of human pancreatic lipase induced by acylation with the inhibitor tetrahydrolipstatin. Eur J Biochem 205 (1992), pp. 383–390.입니다.

>안녕하세요~ ^^ >Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다. >제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~ >시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ 답변 감사합니다~^^ 몇가지 궁금한게 있어서 다시 글을 씁니다. 앞에서 말씀하신 fatty acid의 양을 PH mater로 측정한다고 하셨는데~ 이와 같은 과정으로 실험한 후 480nm 흡광도에서 oleic acid를 정량함으로써 효소활성을 알아보는것도 가능한가요? 그리고 님이 말하시는 저해제란 제 버섯추출물을 뜻하는 것이 맞나요?

UV-vis spectrophotometer로 지방산을 측정하기 위해서는 free oleic acid는 흡광도가 없기 때문에 2-bromoacetyltriphenylene으로 유도체를 만들어서 보는 경우는 있습니다. 유도체화만 시키면 효소활성을 측정하는 것도 가능합니다. 단순 UV-vis 분광광도계 뿐만 아니라 HPLC로도 정량 분석이 가능합니다. 그리고 UV-vis 분광광도계를 사용하지 않고도 stat pH meter로 측정하면 해리된 지방산의 양을 첨가한 NaOH나 KOH의 양으로 계산할 수 있습니다. 그리고 질문자분께서 버섯추출물을 이용한다는 의미가 버섯추출물을 효소 저해제로 사용하고자하는 것으로 이해를 했는데 맞습니까..? 맞는다면 제가 설명드린 방법으로 진행하시면 될 거 같습니다.

>안녕하세요~ ^^>Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다.>제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~>시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ 첨부자료

>안녕하세요~ ^^>Pancreatic lipase activity실험에 관해서 물어보려고합니다.>제가 human pancreatic lipase를 이용해서 실험하려고하는데요~>시그마 회사제품( LIPASE FROM HUMAN PANCREAS, L9780 )을 사용해두 괜찮을까요?? >그리고 human pancreatic lipase를 사용했을때의 method쫌 부탁드려요~ 첨부자료