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님께서 말씀하신 것과 같이 cDNA를 합성한 후에 real-time PCR을 통해서 RNA를 정량하는 경우는 일반적인 세포 수준에서의 변화를 측정하기에는 적당한 방법입니다. 이때에는 reference (GAPDH나 beta-actin, 또는 18S rRNA)를 이용하여 cDNA의 상대적이나 절대적인 량을 측정할 수 있습니다. 물론 절대적인 량을 측정하기 위해서는 타겟이 삽입된 plasmid의 template을 이용하여 표준 곡선을 작성합니다. 이때에는 동일한 volume을 사용한 경우에도 시료 사이의 reference의 비교를 통해 정량화가 가능합니다. 바이러스의 titer를 real time RT-PCR로 측정하는 것도 절대적인 titer 수치를 계산하기 위해서이므로 농도를 알고 있는 타겟 viral RNA를 코드하는 plasmid DNA를 이용하여 표준 곡선을 작성하여 비교 정량하실 수 있습니다. 배양액을 직접 이용하여 단위 volumn 당의 virus titer를 계산하실 수 있습니다. 배양액을 희석하여 희석 배수만 알고 있다면 간단히 비교 계산이 가능합니다. 특히, supernatant 내의 바이러스 titer를 측정하시기 위한 것이라면 normalization 해줄 필요가 없을 것 같군요. Virus의 감염에 따른 세포 내 mRNA의 변화를 측정하시는 것이라면 첫 단락에서 언급한 것과 같이 normalization 없이 reference에 의한 비교로 정량화가 가능합니다. 일반적으로 real time RT-PCR은 2 step으로 reverse transcription 반응에 사용하는 총 RNA량을 normalization (대략 1 ug/reaction) 해준 후에 cDNA를 사용하여 Real time-PCR 반응을 합니다. RNA 바이러스의 titer 측정시에는 RT 반응과 PCR 반응을 동시에 수행하는 1 step을 주로 사용하는 것 같더군요. 다카라의 Retrovirus titer set의 매뉴얼을 첨부합니다. 참고하시길 바랍니다. >Real time PCR을 하는 도중 궁금한 것이 있어 이렇게 질문을 올립니다. > > >A라는 RNA 바이러스가 있습니다. > >이 바이러스를 B cell이 infection을 한 뒤에 > >시간대별로 cell과 바이러스 particle이 들어있을 것으로 생각되는 supernatant를 각각 확보하였습니다. > >그 뒤에 시간 대별로 cell과 sup을 각각 얻었고 그 다음으로 각 샘플로 부터 RNA을 얻었습니다. > >그리고 cDNA를 합성하였습니다 > >그 뒤에 cDNA를 이용하여 real time PCR을 하였습니다. > > > >이 때 발생한 데이타를 standard curve를 이용하여 분석하려 합니다. > > >1) 여기서 제가 궁금한 것이 시간대별, cell간, supernatant간의 total RNA양이 틀립니다. > >이걸 가지고 전부 normalization을 해서 cDNA를 합성해야 하는지요? > >그리고 나서 data 분석시 어떻게 적용되는지 알고 싶습니다. > >2) 만약 양을 normalization하지 않고 그냥 단지 volume을 동일하게 한다면 cDNA 합성시 > >그 양이 달라지는지요? > >이 때 역시 data 분석을 어떻게 해야 하는지 알고 싶습니다. > >3) 저위의 질문과 별개로. 만약 제가 ml당 virus RNA genome copy수를 계산하려 한다면, 어떻게 해야 하는지요? > >예를 들어서 말씀해 주시면 감사하겠습니다. > >4) 혹시 제가 virus particle (RNA genome을 지니는)에 대한 real time PCR과 그에 따른 데이타 분석을 설명한 > >paper나 자료가 있으면 받아보았으면 합니다. > >감사합니다. ^_^

>1) 여기서 제가 궁금한 것이 시간대별, cell간, supernatant간의 total RNA양이 틀립니다. 당연히 틀릴수 밖에 없습니다. 보통 cDNA 합성시에 사용하는 RNA 양만을 사용합니다. 저는 보통 1ug의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하지요. 보통을 이렇게 처음 RT할때의 양을 기준으로 시작을 합니다. 그래야, 시간대별 cell간 supwernatant간의 total RNA별 cDNA가 합성됩니다. 이때 각각 standard curve대비 양을 계산하시면 됩니다. > >2) 만약 양을 normalization하지 않고 그냥 단지 volume을 동일하게 한다면 cDNA 합성시 > >그 양이 달라지는지요? 당연히 달라집니다. 이렇게는 실험을 진행하시면 안되십니다.