KOSEN 한인과학기술자네트워크

현장을 떠난지 10년이 넘어 기억이 가물가물 합니다만. SDS-PAGE의 결과로 보니 낮은 MW의 marker도 나타나지 않은 것으로 보이는데요, 이런 경우는 gel을 처리하는 과정에서의 오류일 수 있는데요, 전개 속도가 너무 빠르거나 늦게 진행되어 나타날 수 도 있구요, volt는 80~150V가 나오도록 power supply의 출력을 조금 더 올리실 필요가 있고, seperation상태에서는 출력이 150V정도로 하셔도 됩니다. 그리고 seperation시간은 band가 완전히 늘어설때까지 넉넉하게 해보시고요, 또 사용하는 전개용매의 pH가 맞지 않거나 contamination되서 그러는 경우도 가능하니 다시 제조하여 해보시는 것도 권해드리고 싶네요, 그리고 염색도 약간 흐릿한 거 같은데 염색시간은 조금 더 늘려잡아도 괜찮구요, 염색시간을 늘리는 대신에 탈색시간도 역시 더 늘리면 더 선명한 밴드를 볼 수 있지 않을까 생각합니다. 이때 염색물의 빠른 제거를 위해 꽃아두는 kimwipes는 자주 갈아주시는 것이 밴드가 더 선명하게 보이는 것 같고요. 쓰다보니, 도움이 안되는 말말 쓴 것 같네요. 감사합니다. >제가 이제 막 배우는 단계라서 잘 모르니까 기본이더라도 많은 부탁드립니다. > >18kd정도되는 밴드 확인을 위해 > >처음에는 12.5% gel을 만들어(짧고 두꺼운것은로..) >했는데... >ladder가(pageRuler Prestained Protein Ladder Plus) >도 이상하게28ld까지는 확인이 되는데... >나머지 아랫부분은 나타났습니다. >당연히 제가 실험했던 protein도 밴드가 나타나지 않았고요~ > >두번째는 선명하게 나타났습니다. >그런데.... 제가 실수로 중간에 마치는 바람에 확인 못했고요~~ > >세번째는 15%에 두껍고 긴 것으로 했는데.. >분명 seperating gel 부근에서는 80v로 했는데... >power supply에서는 80v로 안되고 높아야 68v정도로 내려갔습니다. >ㅠㅠ 밤새 기다려서 했건만... >결과도 이상하게 28kd 아래로는 나타나지 않았습니다. > >E. coli BL21에 pET-21 vecter 거든요... >coloning 해서 이제 마지막으로 확인하는건데... >벌써 3번째 시간을 많이 허비했습니다. >실패로 인해 배우는것은 많은데... >궁금합니다. >사진도 올리니까 알려주세요. > >누군가는 membrain을 깰 때 (sonication) 너무 많이 했다고도 하는데... >5초하고 10초 쉬고 5번 총 25초에서 20%로 했습니다. > >많이 부족합니다. >처음 누군가가 모두 경험한거겠죠?? ^^ 이쁘게 봐주시고... 좋은 답변부탁드립니다.

size marker가 표시 안되어 있고 protein induction을 어떻게 했는지 well에 묘사가 안되어서 잘 모르겠지만 일단은 induction이 안 된 것 같습니다. 다양한 조건으로 해보시고요. 요즘 따로 IPTG 첨가 없이 induction 하는 TB media같은 것들이 있으니 media를 바꾸어 보는 것도 좋습니다. 그리고 젤을 낮은 volt로 천천히 달릴 필요 없습니다. induction 확인 용이라면 한 150v에서 그냥 달리세요. 열나는 것을 우려하면 cold room에서 하거나 ice box에서 해도 상관 없습니다. 오히려 빨리 달리는 것이 좋을 것 같습니다. 혹시 그 단백질이 cell death랑 관련 있거나 그러면 잘 안 될 경우도 있습니다. >제가 이제 막 배우는 단계라서 잘 모르니까 기본이더라도 많은 부탁드립니다. > >18kd정도되는 밴드 확인을 위해 > >처음에는 12.5% gel을 만들어(짧고 두꺼운것은로..) >했는데... >ladder가(pageRuler Prestained Protein Ladder Plus) >도 이상하게28ld까지는 확인이 되는데... >나머지 아랫부분은 나타났습니다. >당연히 제가 실험했던 protein도 밴드가 나타나지 않았고요~ > >두번째는 선명하게 나타났습니다. >그런데.... 제가 실수로 중간에 마치는 바람에 확인 못했고요~~ > >세번째는 15%에 두껍고 긴 것으로 했는데.. >분명 seperating gel 부근에서는 80v로 했는데... >power supply에서는 80v로 안되고 높아야 68v정도로 내려갔습니다. >ㅠㅠ 밤새 기다려서 했건만... >결과도 이상하게 28kd 아래로는 나타나지 않았습니다. > >E. coli BL21에 pET-21 vecter 거든요... >coloning 해서 이제 마지막으로 확인하는건데... >벌써 3번째 시간을 많이 허비했습니다. >실패로 인해 배우는것은 많은데... >궁금합니다. >사진도 올리니까 알려주세요. > >누군가는 membrain을 깰 때 (sonication) 너무 많이 했다고도 하는데... >5초하고 10초 쉬고 5번 총 25초에서 20%로 했습니다. > >많이 부족합니다. >처음 누군가가 모두 경험한거겠죠?? ^^ 이쁘게 봐주시고... 좋은 답변부탁드립니다.

염색 상태로 보아 staining 의 문제가 클 것으로 예상됩니다. Marker 까지 보이지 않는다는 점으로 보아서 staining 을 짧게 한 뒤 overnight destaining 을 하시지는 않았을까 생각이 됩니다. 젤만을 가지고 보았을 때 발현이 되고, 혹은 안되고의 차이를 알 순 없다고 판단이 되고, 젤 전체적으로 band 가 너무 희미하게 보이는 것으로 미루어 보아 다음과 같이 판단이 됩니다. 1. Loading 된 sample 의 양이 적은 것 같습니다. Loading 양을 두세배 정도로 늘려보시기 바랍니다. 2. Staining 시간이 너무 짧거나 destaining 시간이 너무 깁니다. 시간을 조정해 보세요. 3. Staining solution 의 coomassie blue 의 양이 적진 않은지 모르겠습니다. 과량이어도 상관 없으니 5~6 배 정도 늘려주세요. 4. 12.5% 의 gel 로 loading 을 오래한다면 아래로 갈수록 band 가 broad 해지면서 희미해 지기도 합니다. 물론 band 간의 seperation 을 확실히 하기 위해서 필요하기도 하지만 우선 확인을 위해서라면 작은 size 의 단백질은 굳이 오랜 시간 내릴 필요는 없다고 봅니다. 제 답변이 도움이 되셨다면 좋겠습니다. 물론 다른 답변들도 많이 고려해 보시고 빠른 시간 내로 해결이 되셨으면 합니다. 저도 겪어봤지만, PAGE 같은 부수적인 실험절차가 문제되어 실험시간에 영향을 주면 상당히 속상하거든요. >제가 이제 막 배우는 단계라서 잘 모르니까 기본이더라도 많은 부탁드립니다. > >18kd정도되는 밴드 확인을 위해 > >처음에는 12.5% gel을 만들어(짧고 두꺼운것은로..) >했는데... >ladder가(pageRuler Prestained Protein Ladder Plus) >도 이상하게28ld까지는 확인이 되는데... >나머지 아랫부분은 나타났습니다. >당연히 제가 실험했던 protein도 밴드가 나타나지 않았고요~ > >두번째는 선명하게 나타났습니다. >그런데.... 제가 실수로 중간에 마치는 바람에 확인 못했고요~~ > >세번째는 15%에 두껍고 긴 것으로 했는데.. >분명 seperating gel 부근에서는 80v로 했는데... >power supply에서는 80v로 안되고 높아야 68v정도로 내려갔습니다. >ㅠㅠ 밤새 기다려서 했건만... >결과도 이상하게 28kd 아래로는 나타나지 않았습니다. > >E. coli BL21에 pET-21 vecter 거든요... >coloning 해서 이제 마지막으로 확인하는건데... >벌써 3번째 시간을 많이 허비했습니다. >실패로 인해 배우는것은 많은데... >궁금합니다. >사진도 올리니까 알려주세요. > >누군가는 membrain을 깰 때 (sonication) 너무 많이 했다고도 하는데... >5초하고 10초 쉬고 5번 총 25초에서 20%로 했습니다. > >많이 부족합니다. >처음 누군가가 모두 경험한거겠죠?? ^^ 이쁘게 봐주시고... 좋은 답변부탁드립니다.

그러게요. induction 여부도 정도도 확인하기 어렵고, protein 이 soluble fraction 인지 insoluble fraction 인지도 확인하기 어렵네요. 먼저 induction 을 하신 뒤, 일정 시간 후에 sampling 을 하시고, (우리 랩은 시간대별 sampling 을 해서 확인을 하더군요) 그 다음은 cell 을 sonication 후 cell extract 의 supernatant (soluble part) 와 pellet (insoluble) 부분을 모두 PAGE 해서 내 protein 이 soluble 로 갔는지 insoluble 로 갔는지 확인해 보아야겠죠. 간혹 (때론 자주) 모두 insoluble form 으로 발현되어 pellet 으로 다 가버리는 경우도 있으니까요. 발현하신 단백질이 secretion 되지 않고 cell 내에 존재하는 것은 맞죠? (뭐 대부분 E. coli expression 이면 cell 내에 존재하겠지만) marker 는 다른 것으로 바꿔보세요. 그림의 marker 가 말씀하신 제목의 marker 가 맞다면 35KD 이하는 하나도 나오지 않았네요. 그리고, 목적 단백질이 너무 작아서 걱정이 된다면, Tricine-SDS-PAGE 방법을 사용해 보세요. 작은 크기의 단백질을 확인하기 좋답니다. (Analytical Biochemistry, 1987, 166, 368-379)

E.coli 내에서 induction할 때 체크해야할 사항들이 있습니다. 1. Cloning후 frame은 sequencing 분석에 의해 반드시 확인하였는가? (cloning을 계획했던 것과 다를 수 있습니다.) 2. induction시 사용하는 solution은 잘 만들었는가? (때론 일부가 protease에 contamination되는 경우도 있습니다.) 3. induction IPTG 농도는 알맞은가? (induction이 잘되는 단백질은 1 mM의 농도면 induction이 잘 되지만, 때에 따라 조금 다른 condition에서 induction이 되기도 합니다.) 4. 실험자의 기술에 문제가 있는 것은 아닌가? (따라서, 그 전에 잘 되었던 induction sample을 함께 진행합니다. 다른 유전자가 His-tagging되어있는 sample로 말입니다.) control이 없이 실험을 하셨다면, induction이 잘되는 sample을 함께 실험함으로 인해 궁금했던 부분을 해결할 수 있으리라 생각됩니다. 가끔은 제대로 클로닝되고, 제대로 frame이 맞았는데, induction이 안되는 경우도 있습니다. 이론상으론 당연히 되어야하는데, 안되는 경우도 있으니, 가능하다면 유전자의 다른 부분을 이용하여 다시 클로닝하여, induction하는 방법이 있습니다. 우선 sequencing으로 frame이 잘 맞는지 확인해보세요. 도움이 되셨으면 좋겠습니다. 수고하세요~ >제가 이제 막 배우는 단계라서 잘 모르니까 기본이더라도 많은 부탁드립니다. > >18kd정도되는 밴드 확인을 위해 > >처음에는 12.5% gel을 만들어(짧고 두꺼운것은로..) >했는데... >ladder가(pageRuler Prestained Protein Ladder Plus) >도 이상하게28ld까지는 확인이 되는데... >나머지 아랫부분은 나타났습니다. >당연히 제가 실험했던 protein도 밴드가 나타나지 않았고요~ > >두번째는 선명하게 나타났습니다. >그런데.... 제가 실수로 중간에 마치는 바람에 확인 못했고요~~ > >세번째는 15%에 두껍고 긴 것으로 했는데.. >분명 seperating gel 부근에서는 80v로 했는데... >power supply에서는 80v로 안되고 높아야 68v정도로 내려갔습니다. >ㅠㅠ 밤새 기다려서 했건만... >결과도 이상하게 28kd 아래로는 나타나지 않았습니다. > >E. coli BL21에 pET-21 vecter 거든요... >coloning 해서 이제 마지막으로 확인하는건데... >벌써 3번째 시간을 많이 허비했습니다. >실패로 인해 배우는것은 많은데... >궁금합니다. >사진도 올리니까 알려주세요. > >누군가는 membrain을 깰 때 (sonication) 너무 많이 했다고도 하는데... >5초하고 10초 쉬고 5번 총 25초에서 20%로 했습니다. > >많이 부족합니다. >처음 누군가가 모두 경험한거겠죠?? ^^ 이쁘게 봐주시고... 좋은 답변부탁드립니다.

정말 좋으시 답변 너무너무 감사합니다. 여러가지 조언해주신 내용들을 참고해서 다시 용기내서 실험을 진행하려고 합니다. 역시 성공보다는 실패라는 부분에서 배우는 것이 더 많은 것 같아요. 아마도 다시 접종부터 차근차근 진행해서 좋은 결과 만들어 보겠습니다.