2009-03-12
org.kosen.entty.User@186a2be8
최연재(bpmedic)
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미생물 정량 real time PCR 을 하기 위해서 standard를 만들고 있는데요 SYBR1 을 이용해서 Real time pcr을 하려고 specific한 primer를 가지고 PCR을 하여 gel purification을 하고 TA cloning 및 transformation을 하고 있습니다..실험도중에 transformation과정에서 다음단계를 못 넘어가고 있습니다... E.coli competent cell에 형질전환하여 white colony를 얻어서 broth배양 후 plasmid prep을 하여 전기영동을 100v 40분정도 하였습니다. 그런데 몇번이고 다시 해보고 다른과정에서 잘 못되어서 그런지 다시 해보고 해봐도... 밴드가 나타나지가 않습니다... specific primer가 210bp, 350bp 의 크기로 너무 짧아서 결과가 나오지 않은건지.. 아님 다른문제가 있는건지 궁금합니다.. 도와주세요~~~
- real time pcr
- transformation
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답변 1
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답변
신재욱님의 답변
2009-03-13- 0
Real time PCR의 경우 product size가 150-300 bp정도가 적합합니다. 따라서 이 범주를 벗어나지 않는 primer라면 별 문제가 되지 않을 것으로 생각됩니다. 다만, Real time mixture는 좋은 것을 사용하세요. 싸다고 사용하시면 실험이 안될 경우가 많습니다. Real time PCR의 결과가 안 좋을 경우 RT-PCR로 증폭하여 결과를 확인해 보시기 바랍니다. 발현이 안되는 유전자도 많고 증폭이 잘 안되는 유전자도 많기 때문입니다. 또한, control template(actin2 등등, 50cycle이상)로 되는지도 확인해 보시기 바랍니다. 40-45cyle 이상에서 증폭되기 시작하면 발현이 아주 적게되는것이라고 생각합니다.