2009-03-30
org.kosen.entty.User@4d937a6e
이수연(haemong82)
- 4
안녕하세요?
100 bp 크기의 promoter를 6kb vector에 클로닝하는 실험을 하고 있습니다.
promoter는 PCR을 이용해서 확보하고,
Sall과 BamHI으로 잘라서 (vector도 동일한 enzyme으로 자른 후) ligation을 해서
E. coli BL21에 electroporation했습니다.
그런데 콜로니는 뜨는데, plasmid DNA를 prep한 후에 다시 PCR로 확인하면,
insert 크기가 안나옵니다.
vector와 insert 크기가 너무 차이나서 ligation이 제대로 안되는 것일까요??
어떻게 실험 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다.
비슷한 실험 해보신 분,,,,꼭 답변 부탁드릴게요 ㅠㅠ
이 실험만 벌써 3달째 하고있어요 ㅠㅠ
- ligation
- cloning
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답변 4
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답변
한상수님의 답변
2009-03-30- 0
>안녕하세요? >100 bp 크기의 promoter를 6kb vector에 클로닝하는 실험을 하고 있습니다. >promoter는 PCR을 이용해서 확보하고, >Sall과 BamHI으로 잘라서 (vector도 동일한 enzyme으로 자른 후) ligation을 해서 >E. coli BL21에 electroporation했습니다. >그런데 콜로니는 뜨는데, plasmid DNA를 prep한 후에 다시 PCR로 확인하면, >insert 크기가 안나옵니다. >vector와 insert 크기가 너무 차이나서 ligation이 제대로 안되는 것일까요?? >어떻게 실험 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다. >비슷한 실험 해보신 분,,,,꼭 답변 부탁드릴게요 ㅠㅠ >이 실험만 벌써 3달째 하고있어요 ㅠㅠ > cloning 실험을 하고 계시군요. cloning 실험을 할때 여러가지를 고려해봐야 할것이 많습니다. DNA purity 및 restriction은 잘 되었는지, ligation할때 T4 ligase 및 ligation buffer에 DDT나 ATP가 분해되어 있지는 않은지, 또한 competent cell의 competency는 잘나오는지 등등... 여러가지를 고려해야 합니다. 그런데 제가 의문을 삼은것은 실험하시는 분이 2개의 restriction enzyme을 사용하셨는데요. 그렇게 되면 당연히 들어가야 하는것인데요. 실험에 대한 내용을 보니깐 가장 먼저 restriction enzyme에 의해 잘 cutting이 되었나를 확인하시는게 첫번째 일것 같습니다. 왜냐하면 vector self는 나오는것 같으니까요. 그것먼저 확인하시고 insert와 vector의 Mol 비를 잘 조절하셔서 하시면 실험이 될것 같은데요. 가장 cloning 하실때 문제가 되는것이 DNA purity와 잘 안짤리는게 대부분이니 먼저 그부분을 해결하시는게 가장 좋을것 같습니다. -
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오용식님의 답변
2009-04-01- 0
>안녕하세요? >100 bp 크기의 promoter를 6kb vector에 클로닝하는 실험을 하고 있습니다. >promoter는 PCR을 이용해서 확보하고, >Sall과 BamHI으로 잘라서 (vector도 동일한 enzyme으로 자른 후) ligation을 해서 >E. coli BL21에 electroporation했습니다. >그런데 콜로니는 뜨는데, plasmid DNA를 prep한 후에 다시 PCR로 확인하면, >insert 크기가 안나옵니다. >vector와 insert 크기가 너무 차이나서 ligation이 제대로 안되는 것일까요?? >어떻게 실험 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다. >비슷한 실험 해보신 분,,,,꼭 답변 부탁드릴게요 ㅠㅠ >이 실험만 벌써 3달째 하고있어요 ㅠㅠ > 제가 쓴 글을 읽다보니 다소 엉뚱한 답변을 드린것 같아 다시 답변드립니다. 일단 확실히 ligation이 된것이라면 ligation한 vector를 제한효소 처리를 하여 확인을 해보세요, 그러면 확실히 insert가 끼어들어갔는지 확인이 가능하겠죠.. 확인을 PCR로 하신다면... promoter PCR 했을때랑 vector를 PCR 할때랑은...당연히 다른 primer를 쓰시는 거겠죠?? promoter를 PCR하고 제한효소를 처리한다고 하셨는데... 정확히 어느 부분을 제한효소 처리하시는지 알수가 없어 명확한 답을 드리지 못하겠네요..primer에 제한효소 site를 넣어서 PCR을 하시는건지... 정보가 너무 부족하네요...혹시 promoter 내의 서열에 사용하시는 salI이나 BamHI 제한효소 site가 존재하는것은 아닐까요? 이렇다면 PCR이 안될 수도 있다고 생각되는데... 만약 이것이 아니라면, PCR 조건을 하나하나 잡아가심이 좋을듯하네요,, 단, 원하는 insert DNA가 확실히 ligation이 되었다는 조건에서입니다... -
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전정용님의 답변
2009-06-30- 0
insert와 vector의 비율이 3:1 이어야 합니다 확인해 보세요 >안녕하세요? >100 bp 크기의 promoter를 6kb vector에 클로닝하는 실험을 하고 있습니다. >promoter는 PCR을 이용해서 확보하고, >Sall과 BamHI으로 잘라서 (vector도 동일한 enzyme으로 자른 후) ligation을 해서 >E. coli BL21에 electroporation했습니다. >그런데 콜로니는 뜨는데, plasmid DNA를 prep한 후에 다시 PCR로 확인하면, >insert 크기가 안나옵니다. >vector와 insert 크기가 너무 차이나서 ligation이 제대로 안되는 것일까요?? >어떻게 실험 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다. >비슷한 실험 해보신 분,,,,꼭 답변 부탁드릴게요 ㅠㅠ >이 실험만 벌써 3달째 하고있어요 ㅠㅠ > -
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DELETED님의 답변
2010-01-05- 0
>안녕하세요? >100 bp 크기의 promoter를 6kb vector에 클로닝하는 실험을 하고 있습니다. >promoter는 PCR을 이용해서 확보하고, >Sall과 BamHI으로 잘라서 (vector도 동일한 enzyme으로 자른 후) ligation을 해서 >E. coli BL21에 electroporation했습니다. >그런데 콜로니는 뜨는데, plasmid DNA를 prep한 후에 다시 PCR로 확인하면, >insert 크기가 안나옵니다. >vector와 insert 크기가 너무 차이나서 ligation이 제대로 안되는 것일까요?? >어떻게 실험 조건을 잡아야 할지 모르겠습니다. >비슷한 실험 해보신 분,,,,꼭 답변 부탁드릴게요 ㅠㅠ >이 실험만 벌써 3달째 하고있어요 ㅠㅠ > Re: 먼저 strain을 바꿔 보는 것이 좋을 것 같습니다 BL21은 주로 induction시에 많이 쓰는 종이고 효율이 그리 좋지 못합니다. 먼저 cloning은 DH5a 같은 종에서 완성한 후 plasmid를 옮기는 것이 쉬울것 같습니다.