2009-04-08
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주정훈(curior2000)
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Cellular imaging 관련 실험을 하려고 NIH3T3 Cell을 키우고 있는데요
Cell이 자랄수록 부분 부분 multilayer를 형성하는것 같습니다.
ATCC나 다른 논문을 봐도 multilayer형성이 심하지는 않은데요!
왜 제가 키울때는 유독심한걸까요?
그리고 F-actin stainning을 해서 보면 control 상에서도 굉장히 많은
stress fiber가 보이고요
고수님들 도움 부탁드립니다.
지금 culture 하는 조건은 10% calf serum , 1% P/S in DMEM (GIBCO)
를 사용하고 트립신은 0.25% 1X 를 사용하고 있습니다. 이틀간 키워서 4:1로
스플릿하고 트립신은 100파이 컬쳐디쉬에 1ml로 1분간 사용하구요
많은 과학자님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
- NIH3T3
- Cell
- culture
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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답변
신재욱님의 답변
2009-04-08- 0
현미경적인 관찰을 직접하지 않아 구체적으로 말씀드리기는 이렇다 저렇다 하기는 뭐하지만, 저의 견해를 말씀드리자면 일반적으로 세포가 multilayer로 자라는 이유는 공간부족현상때문입니다. 공간이 부족하면 multilayer로 자라게 되고 세포는 stress를 많이 받게 됩니다. 따라서 morpholgy도 안좋아지고 viability도 떨어지게 되죠. 먼저 제 생각엔 media condition상에서 cell growth rate를 측정 해 보시는 것이 좋을 듯합니다. 세포 성장이 굉장히 빠른 듯하구요. 그렇지 않으면 접종 세포수가 너무 많거나요. 이틀간 키워서 split할 정도면 굉장히 빠르게 자라는것 같은데요... 먼저 cell growth rate를 확인 해 보시는 것이 좋을 듯합니다. multilayer로 자라면 정확안 cellular image도 얻기 힘드실 듯 합니다. -
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장성재님의 답변
2009-04-08- 0
님께서 언급해주신 부분에서 특별히 문제될 부분은 없다고 생각됩니다. NIH-3T3는 그다지 특별하거나 키우기 어려운 세포가 아니므로, 세포가 다층을 형성한다면 일단 계대배양할 때 5배이상 희석하시는 것이 좋을 듯 싶군요. 또한, 트립신 처리 후에 세포들이 엉기는 경우도 종종 있으니 피펫팅을 통해서 잘 분리해주시는 것이 좋습니다. 약간 사용하시는 트립신의 농도 및 반응시간이 제가 주로 사용하는 방법과 차이가 있습니다 (저의 경우 0.5 % trypsin-EDTA를 10배 희석한 working sol.을 이용하여 25 cm^2 flask 당 0.5 mL를 배양기에서 5분 정도 반응 시킵니다). 물론 배양 용기의 표면에 부착하여 자라는 세포주이므로 f-actin staining을 통해서 stress fiber가 형성된 것이 확연히 보입니다. 궁금하신 부분이 있으시다면 질문을 더 남기셔도 좋습니다. >Cellular imaging 관련 실험을 하려고 NIH3T3 Cell을 키우고 있는데요 >Cell이 자랄수록 부분 부분 multilayer를 형성하는것 같습니다. >ATCC나 다른 논문을 봐도 multilayer형성이 심하지는 않은데요! >왜 제가 키울때는 유독심한걸까요? >그리고 F-actin stainning을 해서 보면 control 상에서도 굉장히 많은 >stress fiber가 보이고요 >고수님들 도움 부탁드립니다. > >지금 culture 하는 조건은 10% calf serum , 1% P/S in DMEM (GIBCO) >를 사용하고 트립신은 0.25% 1X 를 사용하고 있습니다. 이틀간 키워서 4:1로 >스플릿하고 트립신은 100파이 컬쳐디쉬에 1ml로 1분간 사용하구요 > >많은 과학자님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
주정훈(curior2000) 2009-04-08multilayer 형성은 배양시에 비율을 조금 줄이는 방법으로 해결할수 있을까요? 그리고 공간부족으로 multilayer 형성이 일어나는 것이라면 stress fiber (컨트롤 상에서) 형성도 줄어들까요?자꾸 귀찮게 해서 죄송합니다. 그리고 컨트롤상에서 stress fiber 형성은 당연한건가요? 어떤건지 도저히 몰라서요. 자꾸 귀찮게해서 죄송합니다. 도움 감사합니다.
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신재욱님의 답변
2009-04-09- 0
제 생각에는 어느 정도 해결될 것이라고 생각됩니다. Multulayer로 세포가 자라게 되면 아래쪽에 있는 세포가 영양공굽부족으로 necrosis가 일어날 확률이 높고 그로 인해 세포가 파괴되면서 여러 세포속 성분이 나오면서 다른 세포에 영향을 주기 때문에 문제가 될 가능성이 매우 높습니다. 일단 세포수 조정을 통해 multilayer로 자라는 것을 방지 해 보시고 그에 따른 영향을 관찰하여 보시면 그로 인한 문제인지 아니면 세포의 aggregation등에 의해서도 그러한 문제가 발생될 수 있으니 하나씩 조정하여 확인하는게 급선무일 것 같습니다. -
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전정용님의 답변
2009-06-30- 0
nih3t3 cell 경우에는 너무 잘 자라서 관리하기 힘들기도 합니다. 4:1이라는 비율도 dish 내의 얼마의 세포가 있는냐가 관건이기 때문에 그 비율을 좀더 높게 잡으셔서 키우시는게 좋을듯 합니다 >Cellular imaging 관련 실험을 하려고 NIH3T3 Cell을 키우고 있는데요 >Cell이 자랄수록 부분 부분 multilayer를 형성하는것 같습니다. >ATCC나 다른 논문을 봐도 multilayer형성이 심하지는 않은데요! >왜 제가 키울때는 유독심한걸까요? >그리고 F-actin stainning을 해서 보면 control 상에서도 굉장히 많은 >stress fiber가 보이고요 >고수님들 도움 부탁드립니다. > >지금 culture 하는 조건은 10% calf serum , 1% P/S in DMEM (GIBCO) >를 사용하고 트립신은 0.25% 1X 를 사용하고 있습니다. 이틀간 키워서 4:1로 >스플릿하고 트립신은 100파이 컬쳐디쉬에 1ml로 1분간 사용하구요 > >많은 과학자님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다. -
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DELETED님의 답변
2010-01-05- 0
>Cellular imaging 관련 실험을 하려고 NIH3T3 Cell을 키우고 있는데요 >Cell이 자랄수록 부분 부분 multilayer를 형성하는것 같습니다. >ATCC나 다른 논문을 봐도 multilayer형성이 심하지는 않은데요! >왜 제가 키울때는 유독심한걸까요? >그리고 F-actin stainning을 해서 보면 control 상에서도 굉장히 많은 >stress fiber가 보이고요 >고수님들 도움 부탁드립니다. > >지금 culture 하는 조건은 10% calf serum , 1% P/S in DMEM (GIBCO) >를 사용하고 트립신은 0.25% 1X 를 사용하고 있습니다. 이틀간 키워서 4:1로 >스플릿하고 트립신은 100파이 컬쳐디쉬에 1ml로 1분간 사용하구요 > >많은 과학자님들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다. >NIH3T3 cell은 over-growth하여 층이 생기기 시작하면, transfection효율이 매우 떨어집니다.계대배양을 좀더 잘 해주는 것이 필요합니다.
multilayer 형성은 배양시에 비율을 조금 줄이는 방법으로 해결할수 있을까요?
그리고 공간부족으로 multilayer 형성이 일어나는 것이라면 stress fiber (컨트롤 상에서)
형성도 줄어들까요?자꾸 귀찮게 해서 죄송합니다.
도움 감사합니다.