2009-04-14
org.kosen.entty.User@3a923ff6
김주동(syncn310)
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제목 그대로 저 정도 크기의 protein을 detection하고 있습니다.
다른 분들은 아무리 작아도 antibody만 있으면 쉽게 잡을 수 있다고 하시는데 저는 너무 어렵네요~
일단 low range marker를 가지고 전기영동을 했구요~ gel %는 15%로 했습니다. 18%는 너무 밴드가 이상하게 나오더라구요~
가장 작은 사이즈의 marker가 분리가 되었다 싶을 때 전기영동을 멈추고 transfer를 했습니다. 250mA에서 25분간 했구요~
1장만 transfer 했습니다.
작은 protein 이다보니 짧게 했구요.
그런데 membrane을 coomassie blue로 stain 해보니 membrane상에 6-15사이 부분에 protein들이 보이지 않더군요~ ㅡㅡㅋ
그리고 또 한가지 이상한건 염색된 membrane을 보니까 윗부분의 밴드는 이쁘게 나왔는데 밑부분은 완전 엉망진창으로 되었더군요~ 이것은 transfer가 잘못된 것일가요? 아니면 애당초 전기영동이 잘못된것일까요? 이유를 모르겠어요~ ㅡㅡㅋ
western은 많이 했었지만 이런 작은 사이즈의 실험은 처음이라 좀 힘드네요~ ㅠㅠ
답변 주시면 갑사하겠습니다~
- western
- small protein
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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신재욱님의 답변
2009-04-14- 0
먼저 Gel을 10-20% gradient gel을 사용하여 보십시요. 오히려 gradient gel이 더 잘 분리 시킬 수 있으니까요. 그리고 한가지 transfer시간이 좀 적다는 생각이 드는군요. 단백질이 작다고 해서 transfer 시간을 줄여버리면 transfer가 안되는 경우가 많습니다. 상업용으로 판매하는 gel과 transfer buffer도 1시간-2시간 이상 transfer합니다. 만약 상업용으로 사서 사용한다고 하시면 instruction manual을 다시 한번 읽어보시기 바랍니다. 아니시면 transfer 시간을 늘여 보시기 바랍니다. 그리고 transfer후에 coomassie 염색을 하셨닥 하는데 coomassie 염색은 감도가 낮기 때문에 단백질에 따라서 transfer membrane에서는 안나올수 가 있습니다. 오히려 Ponseaus S를 권장 해드리고 싶습니다. 마지막으로 transfer membrane에서 염색에서 안나와도 항체로 바인딩 후 발색을 시키면 나오는 경우도 있습니다. 항원항체 반응으로 염색약보다 민감핫게 잡을 수 있습니다. 물론 항체 농도는 조정해야 하시겠지만요. -
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김주동님의 답변
2009-04-14- 0
답변 감사드립니다. 덧글에 입력하려 했는데 너무 길어서 안되더군요~ ㅡㅡㅋ 제가 transfer를 끝낸 후 gel 과 membrane을 둘 다 coomassie로 염색을 했었는데 2곳 모두 밑부분에서 protein이 발견되지 않았습니다. 그렇다면 일단 protein이 gel에서 떠난 것은 확실한데 membrane상에도 안나온 것을 보면 결론적으로 membrane을 투과했다고 보아야 하는 걸까요? 저도 시간이 짧아서 transfer가 안되지 않을까 하고 생각은 했지만 제가 쓴 글에서 처럼 윗부분들은 transfer가 되었습니다. 물론 짧게 했으니 100% 되지는 않았지만 분명 transfer가 되었거든요~ ㅜㅜ 윗부분이 transfer가 되었다는 말은 그보다 더 작은 protein도 transfer가 되었다고 봐야겠지요~ 하지만 membrane상에는 나오지가 않습니다~ ㅠㅠ -
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신재욱님의 답변
2009-04-14- 0
Transfer membrane에서 coomassie로 염색했을 경우 membrane 전체가 파랗게 되지 않나요? 그리고 transfer가 되었는지 확인하시기 위해 탈색과정을 거치셨나요? 만약 탈색과정을 거치신다면 붙어있던 단백질이 용출되었을 수도 있습니다. 아무래도 membrane이니까 그리고 transfer를 짧게 하셨다면 더욱 그럴수도 있구요. 단백질에 따라 membrane에 흡착하는 정도가 많이 차이나니까요. 또한 coomassie G-250은 Arg, Lys, aromatic ring이 있는 잔기들(Trp, Tyr, Phe)등과 결합하기 때문에 분자량이 작거나 이러한 아미노산이 적게 함유되어 있는 단백질인 경우에는 흡사 전기영동이 되었더라도 염색이 잘 안되는 경우도 있으며, 전기영동 gel상에서 염색해보시고 단백질이 로딩 양에 비해 염색이 잘 되는지 확인 해보시기 바랍니다. 전기영동 gel상에서 염색이 아주 잘되지 않으면 membrane상에서는 더 확인하시기 어렵습니다. 또 다른 한가지는 transfer시 방향을 반대로 하지 않았나 생각됩니다. 하지만 위쪽에 있는 밴드가 나왔다면 membrane방향은 정상적이었지 않나 생각됩니다. -
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장병기님의 답변
2009-04-14- 0
지금 사용하고 계시는 membrane pore size 가 얼마인가요? 작은 사이즈 분자량의 단백질을 검출할때는 0.2um pore 사이즈를 가진 membrane 을 사용하시면 더 나은 결과을 얻으실수 있습니다. 이미 사용하고 있음에도 확인이 불가한건 여러가지 경우를 고려해 봐야겠지만, 보통 0.45 um pore size membrane 인 경우 ~10 kD 정도의 분자량 단백질을 transfer 하기가 까다롭습니다. 경험상... 만약 현재 사용하고 계신 것이 0.45 um 이면 0.2 um 제품을 이용해보시기 바랍니다.
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박재봉님의 답변
2009-04-14- 0
>제목 그대로 저 정도 크기의 protein을 detection하고 있습니다. > >다른 분들은 아무리 작아도 antibody만 있으면 쉽게 잡을 수 있다고 하시는데 저는 너무 어렵네요~ > >일단 low range marker를 가지고 전기영동을 했구요~ gel %는 15%로 했습니다. 18%는 너무 밴드가 이상하게 나오더라구요~ > >가장 작은 사이즈의 marker가 분리가 되었다 싶을 때 전기영동을 멈추고 transfer를 했습니다. 250mA에서 25분간 했구요~ > >1장만 transfer 했습니다. > >작은 protein 이다보니 짧게 했구요. > >그런데 membrane을 coomassie blue로 stain 해보니 membrane상에 6-15사이 부분에 protein들이 보이지 않더군요~ ㅡㅡㅋ Transfer의 조건은 실험을 해 보아 잘 되는 시간을 잡으면 되것입니다. 단백질이 작을 때는 통과하여 빠지지 않게 하는 것도 중요하지만 항체를 처리하고 세척하는 과정에서 membrane에서 달아나지 않도록 단백질을 고정시켜 주기 위하여 여러가지 cross linker들을 사용하기도 합니다. >그리고 또 한가지 이상한건 염색된 membrane을 보니까 윗부분의 밴드는 이쁘게 나왔는데 밑부분은 완전 엉망진창으로 되었더군요~ 이것은 transfer가 잘못된 것일가요? 아니면 애당초 전기영동이 잘못된것일까요? 이유를 모르겠어요~ ㅡㅡㅋ 밑의 엉망으로 나온 부분은 시료중의 세포막을 구성하는 지질들일 것 같습니다. 그러므로 전기영동을 좀더 내려서 지질들과 단백질을 분리하는 게 필요할 것 같습니다. 다른 분이 지적하신대로 gradient gel을 사용하는 것도 좋은 방법이구요. > >western은 많이 했었지만 이런 작은 사이즈의 실험은 처음이라 좀 힘드네요~ ㅠㅠ > >답변 주시면 갑사하겠습니다~