2009-05-04
org.kosen.entty.User@3b65ef20
전정민(wjdals98)
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안녕하세요~ 제가 knock-out 실험을 디자인하는 도중에, 의문이 있어서요. 다름아니오라 제가 클로닝한 유전자가 현재 pGEM T easy vector에 들어가있는 상태인데요, knock-out 작업을 하기 위해서 km cassete gene을 삽입하려 합니다.
해서 T easy vector는 자르지 않고 insert만 한번 cutting 하는 엔자임만 자르려다 보니, BglII가 알맞더라구요..
근데, km cassete gene과 매칭시키려했더니, 맞는 제한효소가 없어서 인위적으로 PCR을 이용해 insert 가 들어가있는 T easy vector에 넣으려고 하거든요~ 물론 insert 안에 집어넣으려구요..
궁금한점은 BglII를 양쪽 끝에 붙여서 km gene primer를 디자인할때 제한효소 양끝에 일부 염기서열을 더 붙여야되는건지, 아니면 그냥 BglII만 붙여서 프라이머를 디자인해도 되는건지 궁금합니다. 그리고 염기서열을 붙여야된다면 보통 몇개를 붙여서 디자인해야되는지도 궁금해요~
- Bgl II
- km cassette
- knock-out
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답변 1
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답변
정근일님의 답변
2009-05-04- 2
일단 T vector에 clonning은 성공하셨군요 ^^ km cassete gene 이면...KanMX gene인가요; 어쨌든.. bglII의 경우 앞쪽에 2~3개의 여유염기만 더 넣어주면 됩니다. 만약 PCR을 통해 해당 유전자의 사이에 bglII를 넣으려면 bglII 시퀀스 앞에2개, 뒤에 3개의 시퀀스를 더 넣어주어야되지만,맨 앞이나 맨 뒤에 넣으실때는 한쪽 끝에 2~3개의 염기만 더 넣어주면 됩니다. BglII 염기서열이 AGATCT고 km gene이 AAAGGGTTTCCCAAGGTTCC 라고 가정한다면, 5' F 는 GA AGATCT AAAGGGTTTCCC 여유염기 BglII km 시퀀스 앞부분 순으로 짜야되서 GAAGATCTAAAGGGTTTCCC가 되는거구요 3' R 은 GA AGATCT GGAACCTT 여유염기 BglII km 시퀀스 뒷부분 순이되서 GAAGATCTGGAACCTT 가 됩니다. 3' R은 거꾸로 넣는거 아시죠? ^^; 보통 프라이머 짤 때, 저는 34mer로 짜구요 template의 16~20 mer 정도가 들어가게 짜는게 좋습니다. BglII 다 넣어도 8개니깐 나머지 20개 정도는 km gene 시퀀스를 넣으세요^^ 그리고 제한효소마다 작동하기위해 최소로 요구하는 여유염기수는 다릅니다. 예를들어 Nde1의 경우엔 앞에만 7개가 필요하구요,,,;;; 이건 타카라나 다른 엔자임사이트에서 찾으시면 필요한 정보를 찾으실 수 있습니다. 좋은하루 되세요^^
감사합니다~ 덕분에 궁금증이 조금이나마 풀렸어요~