KOSEN 한인과학기술자네트워크

닫기

더 많은 혜택을 위해
로그인 하세요.

지식나눔

지식나눔

NIH3T3 cell에서 microtubule staining 관련 질문 입니다.

2009-05-11 org.kosen.entty.User@f167cef 주정훈(curior2000)
  • 1

첨부파일

NIH3T3 cell을 가지고 microtubule staining 을 하였는데 Detection이 되지 않았습니다. microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 1. washing (cold PBS once time on the ice) 2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix 3. washing (PBS) 4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize 5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) 7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution 9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution 11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) primary는 sigma에서 나오는 Monoclonal anti-alpa Tubulin (T-5186)을 사용하고 Secandary는 sigma에서 나오는 FITC-conjugated anti-mouse IgG (F6257)을 사용합니다. primary는 구입한지 1년 반정도 돼었고 -20도 에서 보관하다가 최근 몇개월간 -80도에서 보관하고있었습니다. 혹시 primary가 변성되었을수도 있는지요? F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
  • NIH3T3 cells
  • microtubule
  • staining
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변! 
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변하기
답변 1
  • 답변

    전정용님의 답변

    2009-06-30
    • 0
    washing 단계에서 너무 과도하게 하면 세포가 다 떨어져 나갈 수 있습니다. 조심하시구요. 용액을 PBS로 바꿔서 해보심은 어떨런지요(TBST는 주로 WB시에 많이 사용하거든요). primary Ab 비율도 생각보다 너무 낮은거 같은데요, 1:200정도까지 올려가면서 확인해 보심이 좋을 듯 합니다. >NIH3T3 cell을 가지고 >microtubule staining 을 하였는데 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >primary는 sigma에서 나오는 Monoclonal anti-alpa Tubulin (T-5186)을 사용하고 >Secandary는 sigma에서 나오는 FITC-conjugated anti-mouse IgG (F6257)을 사용합니다. primary는 구입한지 1년 반정도 돼었고 -20도 에서 보관하다가 최근 몇개월간 -80도에서 보관하고있었습니다. 혹시 primary가 변성되었을수도 있는지요? >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
    답변수정
    washing 단계에서 너무 과도하게 하면 세포가 다 떨어져 나갈 수 있습니다. 조심하시구요. 용액을 PBS로 바꿔서 해보심은 어떨런지요(TBST는 주로 WB시에 많이 사용하거든요). primary Ab 비율도 생각보다 너무 낮은거 같은데요, 1:200정도까지 올려가면서 확인해 보심이 좋을 듯 합니다. >NIH3T3 cell을 가지고 >microtubule staining 을 하였는데 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >primary는 sigma에서 나오는 Monoclonal anti-alpa Tubulin (T-5186)을 사용하고 >Secandary는 sigma에서 나오는 FITC-conjugated anti-mouse IgG (F6257)을 사용합니다. primary는 구입한지 1년 반정도 돼었고 -20도 에서 보관하다가 최근 몇개월간 -80도에서 보관하고있었습니다. 혹시 primary가 변성되었을수도 있는지요? >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
    등록된 댓글이 없습니다.
목록
목록