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지식나눔

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Cell fixation에 관한 질문 입니다.

2009-06-15 org.kosen.entty.User@1c1fd1d 주정훈(curior2000)
  • 2
Cell fixation에 관한 질문입니다. NIH3T3 cell을 가지고 micritubule을 staining 해야 하는데 제가 본 논문중에 4% formaldehyde로 실온에서 30분간 fix하고 fix가 끝난후에 PBS로 5분간 3회 washing을 하는데 PBS에 50mM ammonium chloride를 넣어준채로 washing을 해주더라구요 혹시 그 이유알고 계시거나 관련된 논문 부탁드립니다. 제가 본 논문은 Journal of neurochemistry, 2003, 87, 220-229 Protective effects of lysophosphatidic acid(LPA) on chronic ethanol- induced injuries to the cytoskeleton and on glucose uptake in rat astrocytes 입니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다.
  • Cell
  • Fixation
  • ammonium chloride
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답변 2
  • 답변

    장성재님의 답변

    2009-06-15
    • 2
    4% paraformaldehyde를 이용하여 세포를 고정하신 후에 50mM ammonium chloride가 포함된 PBS로 washing하시는 것은 잔존하는 formaline을 불활성화 (quenching)시키기 위함입니다. 잔존하는 formaline은 소량으로도 항체를 이용한 염색에 있어서 저해를 유발하기도 합니다. >Cell fixation에 관한 질문입니다. >NIH3T3 cell을 가지고 micritubule을 staining 해야 하는데 >제가 본 논문중에 4% formaldehyde로 실온에서 30분간 fix하고 >fix가 끝난후에 PBS로 5분간 3회 washing을 하는데 PBS에 >50mM ammonium chloride를 넣어준채로 washing을 해주더라구요 >혹시 그 이유알고 계시거나 관련된 논문 부탁드립니다. >제가 본 논문은 Journal of neurochemistry, 2003, 87, 220-229 >Protective effects of lysophosphatidic acid(LPA) on chronic ethanol- >induced injuries to the cytoskeleton and on glucose uptake in rat astrocytes 입니다. > >많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다.
    답변수정
    4% paraformaldehyde를 이용하여 세포를 고정하신 후에 50mM ammonium chloride가 포함된 PBS로 washing하시는 것은 잔존하는 formaline을 불활성화 (quenching)시키기 위함입니다. 잔존하는 formaline은 소량으로도 항체를 이용한 염색에 있어서 저해를 유발하기도 합니다. >Cell fixation에 관한 질문입니다. >NIH3T3 cell을 가지고 micritubule을 staining 해야 하는데 >제가 본 논문중에 4% formaldehyde로 실온에서 30분간 fix하고 >fix가 끝난후에 PBS로 5분간 3회 washing을 하는데 PBS에 >50mM ammonium chloride를 넣어준채로 washing을 해주더라구요 >혹시 그 이유알고 계시거나 관련된 논문 부탁드립니다. >제가 본 논문은 Journal of neurochemistry, 2003, 87, 220-229 >Protective effects of lysophosphatidic acid(LPA) on chronic ethanol- >induced injuries to the cytoskeleton and on glucose uptake in rat astrocytes 입니다. > >많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다.
    주정훈(curior2000) 2009-06-15

    좋은 정보 감사합니다. 거듭 여쭙기 죄송하지만 관련된 논문이나
    좀 더 자세한 protocol을 알수 있는 방법이 있을까요?
    아니면 위에 써있는데로 washing을 거쳐주면 돼나요?

  • 답변

    장성재님의 답변

    2009-06-15
    • 2
    microtubule에 대한 염색법에 관련 논문은 google에서 검색을 하시면 쉽게 찾으실 수 있을 겁니다. 제가 언급한 ammonium chloride의 quenching 효과의 부분은 관련 서적 "Transmembrane Signaling Protocols (Humana Press, 저자: Hydar Ali, Bodduluri Haribabu)" 263페이지를 참고한 것입니다. 그러나, 따로 상기 서적을 참고하실 필요는 없으며, 4% formaline으로 고정 후에는 50 mM ammonium chloride in PBS를 사용하셔서 washing (1 time for 10 min)을 해주시면 됩니다. 저는 일반적으로 면역염색시에 포르말린 고정 후 PBS만을 사용하여 5분씩 3회 washing 해주는 것으로 충분하다는 생각입니다만....참고 문헌에 ammonium chloride를 사용하셨다면 그렇게 해주는 것이 좋을 듯 싶습니다. 항원 및 항체에 따라서 차이가 있을 수 있으므로... >Cell fixation에 관한 질문입니다. >NIH3T3 cell을 가지고 micritubule을 staining 해야 하는데 >제가 본 논문중에 4% formaldehyde로 실온에서 30분간 fix하고 >fix가 끝난후에 PBS로 5분간 3회 washing을 하는데 PBS에 >50mM ammonium chloride를 넣어준채로 washing을 해주더라구요 >혹시 그 이유알고 계시거나 관련된 논문 부탁드립니다. >제가 본 논문은 Journal of neurochemistry, 2003, 87, 220-229 >Protective effects of lysophosphatidic acid(LPA) on chronic ethanol- >induced injuries to the cytoskeleton and on glucose uptake in rat astrocytes 입니다. > >많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다.
    답변수정
    microtubule에 대한 염색법에 관련 논문은 google에서 검색을 하시면 쉽게 찾으실 수 있을 겁니다. 제가 언급한 ammonium chloride의 quenching 효과의 부분은 관련 서적 "Transmembrane Signaling Protocols (Humana Press, 저자: Hydar Ali, Bodduluri Haribabu)" 263페이지를 참고한 것입니다. 그러나, 따로 상기 서적을 참고하실 필요는 없으며, 4% formaline으로 고정 후에는 50 mM ammonium chloride in PBS를 사용하셔서 washing (1 time for 10 min)을 해주시면 됩니다. 저는 일반적으로 면역염색시에 포르말린 고정 후 PBS만을 사용하여 5분씩 3회 washing 해주는 것으로 충분하다는 생각입니다만....참고 문헌에 ammonium chloride를 사용하셨다면 그렇게 해주는 것이 좋을 듯 싶습니다. 항원 및 항체에 따라서 차이가 있을 수 있으므로... >Cell fixation에 관한 질문입니다. >NIH3T3 cell을 가지고 micritubule을 staining 해야 하는데 >제가 본 논문중에 4% formaldehyde로 실온에서 30분간 fix하고 >fix가 끝난후에 PBS로 5분간 3회 washing을 하는데 PBS에 >50mM ammonium chloride를 넣어준채로 washing을 해주더라구요 >혹시 그 이유알고 계시거나 관련된 논문 부탁드립니다. >제가 본 논문은 Journal of neurochemistry, 2003, 87, 220-229 >Protective effects of lysophosphatidic acid(LPA) on chronic ethanol- >induced injuries to the cytoskeleton and on glucose uptake in rat astrocytes 입니다. > >많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다.
    주정훈(curior2000) 2009-06-16

    감사합니다. 많은 도움이 돼었습니다.

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