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지식나눔

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Q-Real time PCR

2009-08-12 org.kosen.entty.User@1d4ba8a8 최연재(bpmedic)
  • 3
제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ 일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. 같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... 이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... 그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? 분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다..
  • Q-Real time PCR
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답변 3
  • 답변

    박수제님의 답변

    2009-08-13
    • 0
    저 역시 무슨 말인지 이해가 잘 안되지만... 몇 몇 comment를 드리면.. basic하게 colony PCR을 하면 PCR product가 잘 나오는데.. 막상 DNA를 뽑아서 하면 qPCR이 안된다는 것은 1. 간단히 colony를 따서 qPCR을 해보시면 될 것이고, 2. qPCR에 사용되는 Taq의 경우 pre-denature가 대부분 필요합니다. 확인해보시고, 3. 위에도 전혀 이상이 없으시다면, DNA를 잘못 뽑으신 것이겠죠.. 4. DNA가 잘 뽑혔는지 유무를 확인하려면.. 뽑으신 DNA를 가지고 colony PCR 처럼 해보세요. 그럼 뭐가 문제 인지 아실 것 같은데요... >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다..
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    저 역시 무슨 말인지 이해가 잘 안되지만... 몇 몇 comment를 드리면.. basic하게 colony PCR을 하면 PCR product가 잘 나오는데.. 막상 DNA를 뽑아서 하면 qPCR이 안된다는 것은 1. 간단히 colony를 따서 qPCR을 해보시면 될 것이고, 2. qPCR에 사용되는 Taq의 경우 pre-denature가 대부분 필요합니다. 확인해보시고, 3. 위에도 전혀 이상이 없으시다면, DNA를 잘못 뽑으신 것이겠죠.. 4. DNA가 잘 뽑혔는지 유무를 확인하려면.. 뽑으신 DNA를 가지고 colony PCR 처럼 해보세요. 그럼 뭐가 문제 인지 아실 것 같은데요... >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다..
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    DELETED님의 답변

    2009-08-21
    • 0
    >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다.. Re: 제생각에는 colony를 DW에 dilution 하셔서 해보시는게 좋을것 같습니다. 그리고 real-time PCR을 하신후에 product를 버리지 마시고, gel을 한번 내려 보심이 좋을 것 같습니다. 거기에 정말로 product가 증폭이 되었는지를 먼저확인해야 할것 같습니다.
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    >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다.. Re: 제생각에는 colony를 DW에 dilution 하셔서 해보시는게 좋을것 같습니다. 그리고 real-time PCR을 하신후에 product를 버리지 마시고, gel을 한번 내려 보심이 좋을 것 같습니다. 거기에 정말로 product가 증폭이 되었는지를 먼저확인해야 할것 같습니다.
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    신동욱님의 답변

    2010-01-11
    • 0
    >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다.. colony로부터 direct하게 진행하지 마시고, 귀찮더라도 일단은 plasmid DNA를 확보하신 후에 최소 50 ng/rxn을 넣어보시고, cycle의 수를 50번-60번 정도로 해보세요 그럼에도 불구하고, Real time PCR이 안된다면, Real time에 사용되는 재료들 및 rxn process를 체크해보시길 바랍니다.
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    >제가 미생물 정량 분석을 하고 있는데... > >Real time PCR 하는중 문제가 아주 많이 생겼어요... ㅋㅋ ㅜㅜ > >일반적인 based PCR에서 colony PCR을 해도 밴드가 엄청 잘 떴습니다.. > >같은 방법으로 colony를 따서 chelex와 열처리 한후 Real time PCR에 적용하였으나... > >이런... 아무런 시그널을 찾을수가 없네요.....(baseline아래에서만 보여요) > >DNA 농도가 50ng/ul 되어야 한다는데... > >그렇게 농도가 나오지가 않거든요.... > >plasmid DNA도 50에서~100정도밖에 농도가 나오지 않는데... 이를 어째해야 할까요?? > >분자실험에 너무 무지한지라 많은 조언 부탁드립니다.. colony로부터 direct하게 진행하지 마시고, 귀찮더라도 일단은 plasmid DNA를 확보하신 후에 최소 50 ng/rxn을 넣어보시고, cycle의 수를 50번-60번 정도로 해보세요 그럼에도 불구하고, Real time PCR이 안된다면, Real time에 사용되는 재료들 및 rxn process를 체크해보시길 바랍니다.
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