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>효소활성도 측정을 하고 있는데요.. >원리 자체가 개념이 잡히질 않아서 질문드립니다.. > >첫째로 아밀라제 효소를 측정하게 되면 효소를 처리한 처리구와 효소활성을 억제한 대조구(100도씨에서 30분간 처리한 검액)와의 차이로 그 값을 계산하는데.. 여기서 100도씨로 시료(검액)을 열처리 하는 이유는 무언가요? 활성을 잃으면 기질과의 반응이 전혀 일어나지 않는다는 것 아닌지.... >그리고 여러 시료를 분석법에 의해서 실험을 하다보면 어느것은 정상으로 나오는데 어느것은 마이너스 값이 나오게 됩니다. 즉 활성을 잃은 검액에서 흡광도가 낮게 나오고 정상적인 검액으로 처리한 것은 흡광도가 높게 나와 마이너스 값이 산출되는데 왜그럴까요? 발색은 되는 것으로 보아서 반응이 일어난것 같기는한데... > >그리고 프로티아제 또한 <1>검액을 먼저 TCA와 기질용액을 첨가한 것을 발색시킨 것과 <2>정상적으로 검액을 기질과 반응시킨 후 TCA로 정지시키고 폴린용액으로 발색반응시킨 처리구와의 차이값으로.. <2> - <1> 값으로 산출하는 대에 있어서 값이 마이너스값이 나오는 것은 무슨 원인인가요?? > >답변 좀 부탁드리겠습니다.... 첫번째 질문에 대해서, 열처리 하는 이유는 효소 자체가 단백질 4차원 구조로 되어 있기 때문에 열에 의해 변성이 일어나게 되어서 효소 자체의 활성을 잃어버리게 됩니다. 일종의 반응 stop입니다. 두번째 질문내용에 대해서, 활성을 잃어버리게 되면 기질분해가 매우 낮거나 일어나지 않게 되므로 당연히 발색반응이 매우 낮거나 일어나지 않게 됩니다. 따라서 흡광도가 낮아지게 됩니다. 발색반응은 기질 자체만 있을 때는 일어나지 않지만 효소에 의해서 product로 전환되었을 때 비로서 발색반응이 일어나게 됩니다. 세번째 질문에 대해서, TCA 자체가 효소에 활성저해제 역활을 하거나, 경우에 따라서는 기질과 반응할 수도 있습니다. 마이너스 값이 나왔다는 것은 원치않는 side 반응이 일어났을 가능성이 큽니다. 원인으로 <2>의 경우 효소 뿐만 아니라 기질 또는 그것의 product에와도 반응이 일어났을 가능성이 있습니다. 혹은 실험 자체가 error가 있을 가능성도 배제할 수 없을거 같군요. 재테스트 해보시기 바랍니다.

>효소활성도 측정을 하고 있는데요.. >원리 자체가 개념이 잡히질 않아서 질문드립니다.. > >첫째로 아밀라제 효소를 측정하게 되면 효소를 처리한 처리구와 효소활성을 억제한 대조구(100도씨에서 30분간 처리한 검액)와의 차이로 그 값을 계산하는데.. 여기서 100도씨로 시료(검액)을 열처리 하는 이유는 무언가요? 활성을 잃으면 기질과의 반응이 전혀 일어나지 않는다는 것 아닌지.... >그리고 여러 시료를 분석법에 의해서 실험을 하다보면 어느것은 정상으로 나오는데 어느것은 마이너스 값이 나오게 됩니다. 즉 활성을 잃은 검액에서 흡광도가 낮게 나오고 정상적인 검액으로 처리한 것은 흡광도가 높게 나와 마이너스 값이 산출되는데 왜그럴까요? 발색은 되는 것으로 보아서 반응이 일어난것 같기는한데... > >그리고 프로티아제 또한 <1>검액을 먼저 TCA와 기질용액을 첨가한 것을 발색시킨 것과 <2>정상적으로 검액을 기질과 반응시킨 후 TCA로 정지시키고 폴린용액으로 발색반응시킨 처리구와의 차이값으로.. <2> - <1> 값으로 산출하는 대에 있어서 값이 마이너스값이 나오는 것은 무슨 원인인가요?? > >답변 좀 부탁드리겠습니다.... 대조구를 만들수있는 방법이 몇가지 있는것으로 압니다. 그 중 하나가 말씀하신 열처리 방법이고요 다른 방법으로는 1. 효소의 활성을 억제시키는 물질을 미리 넣어주는 방법과 2. 효소를 넣어주지 않는 방법 등이 있습니다. 저는 효소 활성 측정을 할 때 대조구에 효소를 넣어주지 않는 방법을 사용합니다. 조효소액 대신 DW를 넣어줍니다. 가장 확실한 방법이죠. 효소가 없이는 반응이 일어나지 않을테고 또한 발색도 일어나지 않을테니까요, 하나의 효소를 측정하기 위한 방법은 다양하게 있습니다. amylase의 경우 DNS 용액을 사용하는 방법, iodine 용액을 이용하는 방법 등, 하지만 이러한 방법을 통해서 얻은 측정값을 이용한 유닛을 구하는 식은 다 다릅니다. 값을 측정하는 것은 측정 방법에 따라 유닛을 구해주는 식이 다르므로 마이너스 값이 나왔다고 해서 잘못되었다고 판단할 수 없습니다. 방법에 따른 식에 측정값을 넣어서 유닛을 구해보세요, 그래도 값이 마이너스라면 그때가서 측정이 잘못되었거나 다른 오류가 있다고 판단할 수 있는 것입니다. 한번 유닛을 구해보고 판단하심이 좋을 듯 싶습니다. 그런데요, 질문이 조금 이상한게.. 어떤 방법을 사용하신지는 몰라도, 활성을 잃은 검액은 측정값이 낮게 나오고 정상으로 처리한 것은 높게 나온다고 하셨는데 말씀하신 결과가 정상 아닌가요?? 보통 측정하면 다 그렇게 나오던데;; 활성을 잃은 검액을 blank로 사용해서 정상으로 처리한 것을 측정해야 하실텐데.. 제가 봤을때는 정상으로 나오신거 같은데요?? 측정 및 계산하시는데 있어서 오류를 범하신것 같네요 ^^;;

님께서 언급하신 효소의 활성 측정법은 효소를 열처리 혹은 TCA와 같은 단백질 변성제 (물론 효소도 단백질이므로 변성되어 활성이 정지함)를 처리하여 실험의 대조군으로 사용하시는 것으로 생각됩니다. (1) 반응을 blank로 하여 (2) 반응과의 흡광도 차이를 효소의 활성치로 사용하시는 것이군요. 제 생각에는 활성측정법이 발색반응이고, 아마도 효소액 (검액) 자체가 색을 가지고 있기때문에 검액을 처리하지 않은 대조군이 아닌 활성을 정지시킨 검액을 대조군으로 사용하시는 것으로 보이는군요. 두번째 질문에서 "활성을 잃은 검액에서 흡광도가 낮게 나오고 정상적인 검액으로 처리한 것은 흡광도가 높게 나와 마이너스 값이 산출되는데 왜그럴까요?"은 윗분이 언급하셨듯이 당연한 결과입니다. 그 반대의 경우라면 문제가 있을 수 있지만, 마이너스라고 해도 흡광도의 차이가 0.1 미만일 경우에는 검액 내의 효소의 활성 자체가 없다고 판단하시는 것이 좋을 듯 싶네요. 또한, 검액 자체의 순도 (정제된 효소 검액인지의 여부?) 또는 효소의 특성 (내열성 등)을 고려해 볼 수 있을 것 같습니다. amylase의 발색 반응에 사용하신 기질 및 발색 반응은 어떤 방법인가요? 세번째 질문의 경우도 발색법에 따라서 차이가 있을 수 있겠지만, 위의 질문과 마찬가지로 마이너스의 결과라고 하더라도 큰 차이가 아닐 경우 (<0.1)에는 (2)와 (1)의 차이가 없으므로, 검액의 효소 활성이 없다고 간주하시는 것이 좋을 듯 싶습니다. 참고로 foline 용액을 이용한 발색 반응은 surfactant나 염의 존재 등에 의해서 background 수치가 높다는 단점이 있습니다. 다른 assay 방법을 검토해 보시는 것도 좋을 듯 싶습니다. >효소활성도 측정을 하고 있는데요.. >원리 자체가 개념이 잡히질 않아서 질문드립니다.. > >첫째로 아밀라제 효소를 측정하게 되면 효소를 처리한 처리구와 효소활성을 억제한 대조구(100도씨에서 30분간 처리한 검액)와의 차이로 그 값을 계산하는데.. 여기서 100도씨로 시료(검액)을 열처리 하는 이유는 무언가요? 활성을 잃으면 기질과의 반응이 전혀 일어나지 않는다는 것 아닌지.... >그리고 여러 시료를 분석법에 의해서 실험을 하다보면 어느것은 정상으로 나오는데 어느것은 마이너스 값이 나오게 됩니다. 즉 활성을 잃은 검액에서 흡광도가 낮게 나오고 정상적인 검액으로 처리한 것은 흡광도가 높게 나와 마이너스 값이 산출되는데 왜그럴까요? 발색은 되는 것으로 보아서 반응이 일어난것 같기는한데... > >그리고 프로티아제 또한 <1>검액을 먼저 TCA와 기질용액을 첨가한 것을 발색시킨 것과 <2>정상적으로 검액을 기질과 반응시킨 후 TCA로 정지시키고 폴린용액으로 발색반응시킨 처리구와의 차이값으로.. <2> - <1> 값으로 산출하는 대에 있어서 값이 마이너스값이 나오는 것은 무슨 원인인가요?? > >답변 좀 부탁드리겠습니다....

제가 알고있는 개념이 맞는지 확인차 다시 질문드립니다.. 1> amylase 활성.. 여기서는 즉,100도씨 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액을 조작하는것을 a, 검액을 순수하게 조작하는 것을 b, 로 하여 (a-b)/증류수처리 등으로 산출합니다... 물론 희석배수 등을 곱하여야 정확한 산출이 되는 것인데요... 제가 알기로는 윗분이 그 결과가 당연하다고 하시는데... amylase의 경우는 요오드용액(I2 + KI)을 처리하여 발색시키는 것은 최초 기질이 되는 전분(다당류)에는 반응하여 보라빛을 띄고 만약 효소에 의해 포도당같은 단당류로 분해되었을 경우는 그 분해된 양만큼 발색이 되질 않아 그 차이 값 즉, 검액의 활성을 잃어서 기질인 전분자체의 변화가 없이 요오드용액에 반응하여 짙은 보라색을 띄며(a), 검액에 물리화학적인 처리없이 기질(전분)과 반응하여 단당류 혹은 이당류 등으로 쪼개어 미쳐 반응하지 못하거나 효소활성이 낮아 반응되지 못한 전분(다당류)이 요오드용액에 반응하여 발색되며 이 둘의 차이값은 즉, 효소가 반응하여 발생시킨 단당 혹은 이당류 등이다 라고 알고있는데.. 맞지않나요? 2>protease... 그리고 답글달아주신 분께서 위의 결과가 당연하다 고 하셨는데 그건 프로티아제 실험에서의 적용이시며.. 이 또한 수식이 (식약청고시-의약식품관련) (검액처리구-검액대조구)의 차이값으로 산출하는데요.. 물론 또한 희석배수 외에 표준물질(티로신) 등의 차후 수식이 첨부되긴 하지만요... 여기서 검액대조구는 즉, 대조구를 보통 증류수로 하지만 여기서는 검액을 TCA로 바로 처리하여 단백질침전(반응중지)한 것을 발색조작하여 측정하는 것인데(즉, 기질자체에서 반응이 없으므로 생성되는..분해된.. 티로신(표준물질)이 없을 것으로 판단됨 다만, 다른 처리과정에서 혹은 이미 분해가 진행된상태에서 발생된 티로신 등을 적절한 산출식에 의해 배제함 등).. 여기서는 당연히 대조구의 흡광도가 적게 나와야 하는 것은 당연히 알고 있구요... 즉, 이론적으로 보면 단백질분해효소 활성의 경우 효소액과 기질(카제인)이 반응하여 표준물질인 티로신 등의 아미노산이 얼마나 생성되었다는 것을 가지고 그 활성도를 측정하는 것이니까 아밀라제와 프로티아제의 발색과정이 차이는 있다고 알고있는데요... 주저리주저리 써놔서 당췌 저도 뭐라고 쓴지 잘 모르겠네요... 아무튼 아밀라제의 발색은 전분이 요오드용액에의해 발색되며 분해된 단당류는 발색이 일어나지 않고 프로티아제의 경우는 분해되어 발생된 티로신(표준)등이 폴린용액과 만나 발색이 이루오 지는 값을 산출하는 것이잖아요... 이게 맞지요? 그래서 질문드렸던 것이 그 값이 마이너스값이 나와서 이게 단순하게 실험오류인지.. 아니면 윗분처럼 0.1> 값 에 의해 활성이 없는 것으로 간주해야 하는지 가 궁금해서 질문드렸습니다..... 이 개념이 맞는지 알려주세요 ㅠ.ㅠ

세번째 답글을 올린 사람입니다. amylase와 protease 역가 측정시에 전자와 후자가 측정하는 타겟에서 차이가 있었군요. 식약청 고시에 의거한 실험법이시니 실험법의 개선 방향보다는 실험 데이터에 대한 의문을 풀고 싶으신 것으로 보이네요. 앞서 언급드린 것과 같이 효소 활성을 없앤 대조군의 흡광도가 높게 나온다는 것은 검액 자체에 특정 파장에서의 흡광도가 존재하며, 그것이 활성 정지 처리 (열 또는 TCA 처리)에 의해서 변화한다는 것으로 해석이 됩니다. 결론적으로 말씀드리면 대조군의 활성이 높게 나올 수는 없으므로, (2)-(1)의 수치가 마이너스로 나온 결과는 의미가 없다고 보시면 될 것 같습니다. 실험법을 개선하지 않고는 해결될 수 없는 문제입니다.

>효소활성도 측정을 하고 있는데요.. >원리 자체가 개념이 잡히질 않아서 질문드립니다.. > >첫째로 아밀라제 효소를 측정하게 되면 효소를 처리한 처리구와 효소활성을 억제한 대조구(100도씨에서 30분간 처리한 검액)와의 차이로 그 값을 계산하는데.. 여기서 100도씨로 시료(검액)을 열처리 하는 이유는 무언가요? 활성을 잃으면 기질과의 반응이 전혀 일어나지 않는다는 것 아닌지.... >그리고 여러 시료를 분석법에 의해서 실험을 하다보면 어느것은 정상으로 나오는데 어느것은 마이너스 값이 나오게 됩니다. 즉 활성을 잃은 검액에서 흡광도가 낮게 나오고 정상적인 검액으로 처리한 것은 흡광도가 높게 나와 마이너스 값이 산출되는데 왜그럴까요? 발색은 되는 것으로 보아서 반응이 일어난것 같기는한데... > >그리고 프로티아제 또한 <1>검액을 먼저 TCA와 기질용액을 첨가한 것을 발색시킨 것과 <2>정상적으로 검액을 기질과 반응시킨 후 TCA로 정지시키고 폴린용액으로 발색반응시킨 처리구와의 차이값으로.. <2> - <1> 값으로 산출하는 대에 있어서 값이 마이너스값이 나오는 것은 무슨 원인인가요?? > >답변 좀 부탁드리겠습니다.... 첨부자료