2009-09-29
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곽서영(rhkrtj)
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1.8kb PCR product를 T-easy vector system을 이용해 cloning하고있습니다.
DNA양과 vector양을 조절했는데 ligation도 잘안되고, 그래서 colony도 많이 안뜨고..
어쩌다 insert가 확인되면 정확한 size의 insert 가 아닙니다..
문제가 많이 있는거겠지요?
PCR product는 elution해서 ligation하고..
band contamination이라고 하기엔.. product size 차이가 많이 납니다..
1.8kb정도면 그닥 큰 사이즈도 아니라고 하시던데..
advice좀...ㅜㅜ
- T-easy vector
- PCR product cloning
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답변 5
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한재석님의 답변
2009-09-29- 0
물론 당연히 아시겠지만 taq polymerase에는 A overhang이 될 수 있는 것을 써야합니다. 그리고 콜로니가 많이 안뜬다는 것은 ligation자체가 잘 안되었을 가능성이 큽니다. Positive control을 써보는 것도 하나의 방법입니다. T vector가 안 좋을 수도 있으니까요. 그리고 PCR후 gel elution을 하셨는지 궁금하네요. 만약 gel elution을 하셨다면 T vector와 insert사이의 molar ratio를 어떻게 하셨는 지도 궁금합니다. 보통 1:3 정도를 많이 쓰니까요. 이 두가지 정도 해보면 대략 답이 나오지 않을까요? >1.8kb PCR product를 T-easy vector system을 이용해 cloning하고있습니다. >DNA양과 vector양을 조절했는데 ligation도 잘안되고, 그래서 colony도 많이 안뜨고.. >어쩌다 insert가 확인되면 정확한 size의 insert 가 아닙니다.. >문제가 많이 있는거겠지요? >PCR product는 elution해서 ligation하고.. >band contamination이라고 하기엔.. product size 차이가 많이 납니다.. >1.8kb정도면 그닥 큰 사이즈도 아니라고 하시던데.. >advice좀...ㅜㅜ -
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곽서영님의 답변
2009-09-30- 0
T-vector의 control실험도 물론 해봤습니다. 그때 control실험은 문제없이 거의 transformation 되었고... molar ratio는.. 이게좀 걸리긴한데 insert양에 비해 vector양을 엄청 적게넣고 ligation반응을 했습니다. 음..... molar ratio보다는.. self ligation이라도 되서 colony라도 많이 떴음 좋겠는데... ligation부터 잘안되는것 같아서 답답합니다ㅜ colony 가 엄청적게떠요ㅜ vector가 과량일시에도 ligation 에 문제가 되는겁니까? 아니면 kit내의 ligase말고, 다른 T4 DNA ligase를 써보는건... 어떨가요? >1.8kb PCR product를 T-easy vector system을 이용해 cloning하고있습니다. >DNA양과 vector양을 조절했는데 ligation도 잘안되고, 그래서 colony도 많이 안뜨고.. >어쩌다 insert가 확인되면 정확한 size의 insert 가 아닙니다.. >문제가 많이 있는거겠지요? >PCR product는 elution해서 ligation하고.. >band contamination이라고 하기엔.. product size 차이가 많이 납니다.. >1.8kb정도면 그닥 큰 사이즈도 아니라고 하시던데.. >advice좀...ㅜㅜ
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오용식님의 답변
2009-09-30- 0
gel elution 하시나요? PCR product를 사용하는데 gel elution이 필요한가요? 그냥 PCR purification kit으로 정제하고 사용시면 되는데;; gel elution하여 cloning 하기도 하겠지만,, PCR product를 ligation하는데 gel elution은 너무 비효율적이라는 생각이 드네요.. (PCR product가 1개가 아니라 여러개라면 말이 틀려지지만...) 간혹 gel elution 과정이 안좋아서 안되는 경우도 있습니다. 간혹이 아니라...이런 경우 허다합니다.;;; (제 경험상..) 그러니, gel elution하신다면 그러지 마시고 PCR product 1ul만 전기영동 상에서 확인하시고, 제대로 PCR 됐다면 남은 양으로 purification kit 쓰셔서 정제하시고 사용해보세요
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DELETED님의 답변
2009-10-06- 0
>1.8kb PCR product를 T-easy vector system을 이용해 cloning하고있습니다. >DNA양과 vector양을 조절했는데 ligation도 잘안되고, 그래서 colony도 많이 안뜨고.. >어쩌다 insert가 확인되면 정확한 size의 insert 가 아닙니다.. >문제가 많이 있는거겠지요? >PCR product는 elution해서 ligation하고.. >band contamination이라고 하기엔.. product size 차이가 많이 납니다.. >1.8kb정도면 그닥 큰 사이즈도 아니라고 하시던데.. >advice좀...ㅜㅜ Re: 보통 T-A cloning 시 colony개수가 적다는것은 insert량이 부족한경우가 많습니다. 간단히 insert량을 늘려 보세요.. molar ratio가 중요하긴하나 보통cloning보다는 그리 영향을 받지는 않으니까요.. 그리고 gel elution을 하셨다면 A-tail이 떨어지는 경우가 종종 있습니다. A-tailing을 하시고 다시 ligation해보세요..insert량 많이~ -
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신동욱님의 답변
2010-01-10- 0
>1.8kb PCR product를 T-easy vector system을 이용해 cloning하고있습니다. >DNA양과 vector양을 조절했는데 ligation도 잘안되고, 그래서 colony도 많이 안뜨고.. >어쩌다 insert가 확인되면 정확한 size의 insert 가 아닙니다.. >문제가 많이 있는거겠지요? >PCR product는 elution해서 ligation하고.. >band contamination이라고 하기엔.. product size 차이가 많이 납니다.. >1.8kb정도면 그닥 큰 사이즈도 아니라고 하시던데.. >advice좀...ㅜㅜ 1. PCR product를 gel elution하여 일단 contamination을 방지합니다 2. TA cloning vector를 fresh하게 사용하여야 합니다. T overhang을 체크해야 합니다 3. 사이즈가 다소 크므로, 조건을 서너개 잡은 후에 ligation을 하시길 바랍니다