2010-01-06
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권정희(buny89)
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LC/MS로 DNA methylation 분석시에 LC/MS로 측정할 수 있는 이유가 궁금합니다.
- DNA methylation
- Mass spectrometry
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
이상후님의 답변
2010-01-06- 2
>LC/MS로 DNA methylation 분석시에 LC/MS로 측정할 수 있는 이유가 궁금합니다. MALDI-TOF mass spectrometry가 아닌 LC/MS로 DNA상의 methylation 정도를 정량 분석 할 수 있는 것은 DNA 그 자체 또는 oligonucleotides로는 어렵다고 볼 수 있습니다. 결국, 개개 nucleotide 단위로 hydrolysis 시킨 후에 base 부분만을 분석하기 때문에 LC/MS/MS로 분석이 가능합니다. (LC/MS/MS의 FW의 한계는 3000 미만이므로) 또한 사용하는 LC/MS도 tandem MS(LC/MS/MS)이어야 가능할 것입니다. 간략하게 protocol을 설명드리면, - whole blood에서 DNA를 extraction해야 되고 - extracted DNA의 purity를 check해야 되고(주로 nanodrop machine을 사용함, 260/280 nm) - 대략 1 ug의 DNA가 얻어져야 바람직함. - formic acid로 hydrolysis 시킴 - 여기에 internal standard 첨가 - LC/MS/MS 분석 마지막으로 % methylation은 nmolmCyt/(nmolmCyt + nmolCyt)x 100) 으로 정량하면 됩니다. -
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이상후님의 답변
2010-01-06- 2
>LC/MS로 DNA methylation 분석시에 LC/MS로 측정할 수 있는 이유가 궁금합니다. 질문자 분께서 필요로 하시는 reference를 첨부합니다. 위에 설명한 protocol을 좀 더 자세하게 확인하실 수 있습니다.
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안길홍님의 답변
2010-01-06- 0
첨부파일
DNA methylation에만 국한하여 말씀드리는 것보다 methylation후에 왜 LC/MS에 의하여 측정가능한지에 대하여 말씀드리겠습니다. Methyl binding 단백질로써 촉매 작용을 하는 효소에 의하여 DNA가 methylation되는데, MS/LC는 기본적으로 electron의 조사에 의하여 작동하는 원리를 가지고 있습니다. methyl radical은 CH3+의 구조를 가지며,이의 mass-to-charge ratio는 15가 되며 이는 전자를 수용하여 exciting되는 화학구조입니다. 따라서 Methyl radical단독으로 LC/MS상에서는 15부근에서 peak가 나오지만 이에 단백질 구조가 결합한 methylated protein은 peak가 15이상에서 나타나는 것이 정상입니다.DNA자체는 mass-to-charge ratio가 나오지 않기 때문에 LC/MS로 측정은 되지 않지만 이를 methylation하게 되면 mass-to-charge ratio가 나오기 때문에 로렌츠의 힘의 법칙을 기본으로 하는 LC/MS에서는 힘F=Q(E+VxB)에 의하여 측정되므로 가능하다는 것이 기본 원리입니다. 위의 기본은 비록 DNA에 국한되는 것이 아니고 모든 methylation에 적용되는 기본 원리입니다(LC/MS에서는 mass-to-charge ratio가 항상 고려하여야 되는 원칙임)
답변 감사합니다. 그런데 혹시 관련 논문이나 자료가 있으시면 첨부해주시면 감사하겠습니다.