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지식나눔

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Western blot 에서 protein loading volume

2010-01-08 org.kosen.entty.User@2020c3b9 유현정(totoros)
  • 8
protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? 설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. A protein 1.0 ug/ul 100 ul B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, well 당 20 ug씩 loading 한다면 1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 어떤 방법이 좋은가요? 그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요?
  • 웨스턴 블롯
  • SDS-PAGE
  • protein 정량
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답변 8
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    김범수님의 답변

    2010-01-11
    • 2
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > loading volume에 따른 영향은 없습니다. 농도만 조절하면 되는 것으로 알고 있습니다. 그래도 동일한 volume으로 loading 되도록 조절해주는 것이 편하겠지요.
    답변수정
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > loading volume에 따른 영향은 없습니다. 농도만 조절하면 되는 것으로 알고 있습니다. 그래도 동일한 volume으로 loading 되도록 조절해주는 것이 편하겠지요.
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    DELETED님의 답변

    2010-01-08
    • 0
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Re: 별 상관 없습니다. 그러나, band 모양은 아무래도, 동일한 vol을 loading하는 것이 더 좋습니다. vol이 다른 경우 저항이 각기 조금씩 다르게 걸리므로, band가 물결을 치는 경우가 있습니다.
    답변수정
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Re: 별 상관 없습니다. 그러나, band 모양은 아무래도, 동일한 vol을 loading하는 것이 더 좋습니다. vol이 다른 경우 저항이 각기 조금씩 다르게 걸리므로, band가 물결을 치는 경우가 있습니다.
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    이상후님의 답변

    2010-01-08
    • 0
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Gel image를 nice하게 만들기 위해서는 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 가장 이상적이긴 하나, 질량은 반드시 동일하게 할 필요는 없는거 같군요. 질량 차이에 따라서 밴드의 크기가 약간 다를 뿐이니깐요. 하지만 Loading volumn이 커질수록 band 두께가 넒어지고 경우에 따라선 band overlap과 tailing 현상이 일어나기도 하죠..
    답변수정
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Gel image를 nice하게 만들기 위해서는 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 가장 이상적이긴 하나, 질량은 반드시 동일하게 할 필요는 없는거 같군요. 질량 차이에 따라서 밴드의 크기가 약간 다를 뿐이니깐요. 하지만 Loading volumn이 커질수록 band 두께가 넒어지고 경우에 따라선 band overlap과 tailing 현상이 일어나기도 하죠..
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    신동욱님의 답변

    2010-01-08
    • 0
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Loading하는 최종 양을 동일하게 하는 것은 volume이 다르더라도 상관은 없습니다. 다만, Gel에 오랫동안 loading하게 되면, volume 차이에 의해서 같은 band임에도 불구하고 차이가 날 수 있습니다. 따라서, 좀 귀찮더라도, 동일한 양을 맞추고, 5X sample buffer를 맞추면서 RIPA buffer (또는 PBS)등으로 보정을 해서 volume을 동일하게 하여 loading하세요
    답변수정
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > Loading하는 최종 양을 동일하게 하는 것은 volume이 다르더라도 상관은 없습니다. 다만, Gel에 오랫동안 loading하게 되면, volume 차이에 의해서 같은 band임에도 불구하고 차이가 날 수 있습니다. 따라서, 좀 귀찮더라도, 동일한 양을 맞추고, 5X sample buffer를 맞추면서 RIPA buffer (또는 PBS)등으로 보정을 해서 volume을 동일하게 하여 loading하세요
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    최재민님의 답변

    2010-01-09
    • 0
    제가 실험 할때는 다른 농도를 가지고 볼륨을 바꿔서 loading을 했습니다. 이때 60V정도로 running을 하면 upper gel에서 한줄로 정렬됩니다. 그리고 나서 전압을 바꾸면 일정하게 loading이 되었어요. >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > >
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    제가 실험 할때는 다른 농도를 가지고 볼륨을 바꿔서 loading을 했습니다. 이때 60V정도로 running을 하면 upper gel에서 한줄로 정렬됩니다. 그리고 나서 전압을 바꾸면 일정하게 loading이 되었어요. >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > >
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    서기원님의 답변

    2010-01-11
    • 0
    님께서 원하는 것은 동일 단백질의 양을 로딩하고 싶는게 목적일껍니다. 그래서 volum을 맞추어 하는 것과, volum은 다르지만 그냥 질량을 다른 부피로 넣어 주는 방법에서 어떤게 좀더 정확할까 고민하시는것 같은데.. 둘다 상관 없습니다.. 어차피 단백질의 양만 동일하게 들어간다면 편한 방법으로 하세요,. .. 방법보다는 님께서 얼마나 정확하게 실험을 수행하느냐가 좀더 영향이 큼니다. 그리고 님께서 말하 두가지 방법이 근본적으로는 혼용해서 사용됨니다.. 예를 들면, 이해를 위해 좀 극단적으로 설명하면 농도가 A-100ug/ml, B-5mg/ml의 두가지 샘플을 가지고 실험 한다면, 단백질 로딩 양이 1ug을 원한다면 , A는 그냥 10ul를 넣으면 되고 B는 0.2ul를 넣으면 되겠죠.. 그러나 0.2를 넣을수는 있지만 오차가 커지기 때문에 어쩔수 없이 B를 희석해서 사용해야 하고 만약 10배를 희석하면 2ul, 50배 희석하면, 10ul를 넣겠죠,. 뭐가 다름니까?? 비슷하죠!!!, 본인이 실험에 뭐가 더 편한지 더 정확한지는 그때 그때 실험 상황에 따라 조금 다르지만 원하는 결과를 위해서 더 좋은 방법은 구분할 수 없습니다. 그리고 두가지 방법중 하나를 사용하는게 아니라 적당히 편리에 의해 두 방법을 혼용하여 사용하는게 일반적입니다. 하지만,, 일반적으로는 volum를 맞추는게 더 귀찮고 힘들겠죠.. 농도가 정수나 배수 관계로 딱 떨어지지 않을테니가요.. 다만, 조심할껀,, 희석할때 너무 큰 비율로 하시면, 에러가 더 커질수 있으니 가능하면 적은 희석 비율로 실험하시고, 또 피펫의 에러 범위가 있을테니, 0.5, 1ul같은 너무 적은 volum의 실험을 피하는게 좋습니다..
    답변수정
    님께서 원하는 것은 동일 단백질의 양을 로딩하고 싶는게 목적일껍니다. 그래서 volum을 맞추어 하는 것과, volum은 다르지만 그냥 질량을 다른 부피로 넣어 주는 방법에서 어떤게 좀더 정확할까 고민하시는것 같은데.. 둘다 상관 없습니다.. 어차피 단백질의 양만 동일하게 들어간다면 편한 방법으로 하세요,. .. 방법보다는 님께서 얼마나 정확하게 실험을 수행하느냐가 좀더 영향이 큼니다. 그리고 님께서 말하 두가지 방법이 근본적으로는 혼용해서 사용됨니다.. 예를 들면, 이해를 위해 좀 극단적으로 설명하면 농도가 A-100ug/ml, B-5mg/ml의 두가지 샘플을 가지고 실험 한다면, 단백질 로딩 양이 1ug을 원한다면 , A는 그냥 10ul를 넣으면 되고 B는 0.2ul를 넣으면 되겠죠.. 그러나 0.2를 넣을수는 있지만 오차가 커지기 때문에 어쩔수 없이 B를 희석해서 사용해야 하고 만약 10배를 희석하면 2ul, 50배 희석하면, 10ul를 넣겠죠,. 뭐가 다름니까?? 비슷하죠!!!, 본인이 실험에 뭐가 더 편한지 더 정확한지는 그때 그때 실험 상황에 따라 조금 다르지만 원하는 결과를 위해서 더 좋은 방법은 구분할 수 없습니다. 그리고 두가지 방법중 하나를 사용하는게 아니라 적당히 편리에 의해 두 방법을 혼용하여 사용하는게 일반적입니다. 하지만,, 일반적으로는 volum를 맞추는게 더 귀찮고 힘들겠죠.. 농도가 정수나 배수 관계로 딱 떨어지지 않을테니가요.. 다만, 조심할껀,, 희석할때 너무 큰 비율로 하시면, 에러가 더 커질수 있으니 가능하면 적은 희석 비율로 실험하시고, 또 피펫의 에러 범위가 있을테니, 0.5, 1ul같은 너무 적은 volum의 실험을 피하는게 좋습니다..
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    안길홍님의 답변

    2010-01-12
    • 0
    URL에 접속하시면 해당 사항을 해결가능합니다.
    답변수정
    URL에 접속하시면 해당 사항을 해결가능합니다.
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    전정용님의 답변

    2010-02-25
    • 0
    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > 크게 상관은 없지만 동일한 볼륨으로 하는것이 확실히 밴드가 이쁘게 나오더군요 로딩할때도 빈 콤에도 버퍼로 채워주는게 결과가 좋게 나옵니다...
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    >protein 정량 후 각각의 정량값이 다른 protein을 SDS-PAGE gel에 loading 할 경우 >정량값을 토대로 sample을 희석하여 농도를 동일하게 한 다음, 최종 loading volume을 동일하게 하여 동일한 질량을 loading하는 것이 좋을까요? 아니면 그냥 서로 다른 농도의 protein을 volume을 다르게 하여 질량을 맞추어 loading 하는 것이 정확할까요? > > >설명이 복잡하다면 예를 들어 보겠습니다. >A protein 1.0 ug/ul 100 ul >B protein 1.5 ug/ul 100 ul이 있을 경우, > >well 당 20 ug씩 loading 한다면 >1) A protein의 농도로 맞추기 위해 B protein에 50 ul의 lysis buffer를 더 넣어주고 A, B protein 모두 20 ul씩 loading 하는 방법 >2) 희석할 필요없이 A는 20 ul를, B는 13.33ul을 loading 하는 방법 > >어떤 방법이 좋은가요? >그리고, 5 X sample buffer 를 넣고 boiling 할 경우 0.8 을 곱하여 계산하면 되는 것인가요? > > 크게 상관은 없지만 동일한 볼륨으로 하는것이 확실히 밴드가 이쁘게 나오더군요 로딩할때도 빈 콤에도 버퍼로 채워주는게 결과가 좋게 나옵니다...
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