2010-05-21
org.kosen.entty.User@720dac2
김주동(syncn310)
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안녕하세요~ 저는 이제 막 FACS를 배우고 있는데요.
모르는게 죄는 아니다 싶어 이렇게 도움을 구하고자 글을 올립니다~^^;
FACS에 대한 기본적인 원리 및 대충의 사용법은 알고 있으나 모르는 부분이 너무나도 많네요~ ㅠㅠ
제대로 배울려면 3~4달은 공부를 해야 한다니~ ㅜㅜ
FACS data 분석 시 저로서는 잘 이해가 안가는 부분이 있습니다.
data가 나오고 그 화면을 4등분하여서 1분면 2분면 3분면 4분면 이런 식으로 나눠서 해석을 하던데요.
거기서 각 분면이 무엇을 뜻하는 지는 알고 있습니다. 예로 FITC(FL1)와 PE(FL2)로 stain한 물질의 data라면 좌측 윗부분 부터 -/+ , +/+ , -/- , +/- 이런 식으로요.
이것을 POSITIVE와 NEGATIVE라고 하더군요. 형광물질이 반응을 했다 안했다 라는 건 알겠는데 그것이 의미하는 것이 뭔지 모르겠습니다.
예를 들어서 CD4를 FACS로 찍었을 때 확연히 pasitive와 negative로 나뉘는 걸 볼 수 있는데요. 왜 이러한 모양이 나오나요? 전 자꾸 pasitive와 negative라는 개념이 activation이 됐다 안됐다 라는 개념으로 잡히네요. 자극을 주면 전부 자극을 받아 activation이 되야 하는 거고 자극을 안주면 전부 그대로 있어야 되는거 아닌가요? (물론 자극을 준다고 해서 처리하는 모든 cell들이 자극을 받는 것은 아니지만 그래도 80~90%는 받아야 하는 거 아닌가요?)
제가 이렇게 생각하는 이유는 그동안 계속 western을 주로 해 와서 이런 것 ？습니다. western은 cell에 자극을 주냐 안주냐가 거의 명확하게 나오기 때문에 이런 식의 data에 제가 동화(?)가 돼서 자꾸 감이 안잡히는 것 같네요~ ㅠㅠ
어찌 보면 정말 이상한 질문이 될 수도 있겠지만 꼭 좀 알았으면 좋겠습니다. 저도 잘 개념이 안잡히다 보니 제가 써 놓고도 말이 이상하네요~ㅡㅡz
답변 주시면 감사하겠습니다.
- FACS
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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김동현님의 답변
2010-05-24- 0
FACS의 가장 큰 장점 중 하나가 각각의 세포 수준에서 결과를 확인할 수 있다는 것입니다. Western의 경우에는 전체에 대한 결과를 확인하는 것임에 비해, 각각의 세포 수준에서 결과를 확인할 수 있기 때문에, 전체 중에서 몇 %의 세포가 positive인지 확인하는 것이 가능합니다. 예를 들어 혈액 안에는 많은 종류의 면역 세포들이 있는데, 그 중 형광이 labeling된 anti-CD4 Ab로 염색을 하면 CD4를 발현하는 세포만 + 영역에서 확인이 됩니다. FACS는 활용범위가 넓어서 모든 것을 다 알려면 시간이 오래 걸리지만, 사용하고자 하는 몇몇 용도에 대해서만 익히고자 한다면 그렇게 많은 시간이 걸리지는 않을 것입니다. 앞으로 좋은 결과 있으시길 기대합니다. >안녕하세요~ 저는 이제 막 FACS를 배우고 있는데요. > >모르는게 죄는 아니다 싶어 이렇게 도움을 구하고자 글을 올립니다~^^; > >FACS에 대한 기본적인 원리 및 대충의 사용법은 알고 있으나 모르는 부분이 너무나도 많네요~ ㅠㅠ > >제대로 배울려면 3~4달은 공부를 해야 한다니~ ㅜㅜ > >FACS data 분석 시 저로서는 잘 이해가 안가는 부분이 있습니다. > >data가 나오고 그 화면을 4등분하여서 1분면 2분면 3분면 4분면 이런 식으로 나눠서 해석을 하던데요. > >거기서 각 분면이 무엇을 뜻하는 지는 알고 있습니다. 예로 FITC(FL1)와 PE(FL2)로 stain한 물질의 data라면 좌측 윗부분 부터 -/+ , +/+ , -/- , +/- 이런 식으로요. > >이것을 POSITIVE와 NEGATIVE라고 하더군요. 형광물질이 반응을 했다 안했다 라는 건 알겠는데 그것이 의미하는 것이 뭔지 모르겠습니다. > >예를 들어서 CD4를 FACS로 찍었을 때 확연히 pasitive와 negative로 나뉘는 걸 볼 수 있는데요. 왜 이러한 모양이 나오나요? 전 자꾸 pasitive와 negative라는 개념이 activation이 됐다 안됐다 라는 개념으로 잡히네요. 자극을 주면 전부 자극을 받아 activation이 되야 하는 거고 자극을 안주면 전부 그대로 있어야 되는거 아닌가요? (물론 자극을 준다고 해서 처리하는 모든 cell들이 자극을 받는 것은 아니지만 그래도 80~90%는 받아야 하는 거 아닌가요?) > >제가 이렇게 생각하는 이유는 그동안 계속 western을 주로 해 와서 이런 것 ？습니다. western은 cell에 자극을 주냐 안주냐가 거의 명확하게 나오기 때문에 이런 식의 data에 제가 동화(?)가 돼서 자꾸 감이 안잡히는 것 같네요~ ㅠㅠ > >어찌 보면 정말 이상한 질문이 될 수도 있겠지만 꼭 좀 알았으면 좋겠습니다. 저도 잘 개념이 안잡히다 보니 제가 써 놓고도 말이 이상하네요~ㅡㅡz > >답변 주시면 감사하겠습니다. > -
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김윤상님의 답변
2010-05-24- 0
아시겠지만, Flow cytometry는 일정한 파장의 빛을 쏘아서 (excitation 시키는 빛), 세포 내 여러 성분들이 해당 파장의 빛에 따라 방출하는 (emission) 에너지를 검출해서 data를 얻는 것입니다. 따라서, 쏘아준 일정 파장의 빛에 대해 형광 물질 혹은 세포내 여러 성분들이 (FSC, SSC) 방출하는 에너지를 감지하는 여러 sensor 들이 각각 해당 파장에 따라 정보들을 모아줍니다. 강도가 높을 수록 해당 축에서 오른쪽(histogram, x-axis) 혹은 위쪽(y-axis)으로 값이 얻어집니다. 어느 쪽이 x-axis냐 y-axis냐는 편의상 혹은 사람들이 많이 사용하는 쪽으로 결정되는 것일뿐, 꼭 이렇게 해야만 한다는 규칙은 없습니다. histogram을 쓰는 경우는 x-축이 형광 강도이고, y축은 event가 됩니다. 자극에 대해 반응하는 식으로 생각하시는 건 잘못된 이해입니다. 해당 excitation light에 반응하는 형광물질을 가진 세포만 해당 emission 을 release하기 때문에 CD4-PE의 경우, CD4 T 세포만 PE가 붙은 항체를 세포면에 가지고 있을 것이고, 이 형광 물질만 주어진 파장의 빛에 반응하기 때문에 다른 세포들은 음성으로 나옵니다. 또, 얼마나 많은 물질이 표면 (혹은 세포내)에 위치하느냐에 따라 형광물질이 내는 emission의 강도가 달라지므로 intensity 에 해당하는 x축 y축의 값이 커지거나 작아지게 됩니다. 얼마나 작은 것을 음성으로 보는가는, 항상 Control이 중요합니다. 대개 isotype control을 쓰게 됩니다. western을 하셨다니까, 더 이해하기 쉬울텐데요... western에도 preimmune serum 같은 것으로 control 실험을 했던 시절이 있었습니다. 그리고, densitometry를 아신다면, 훨씬 쉽게 이해될 겁니다. 단백질이 많을수록 western blot에서 band의 강도가 큰 것처럼 말이죠. 이해가 되셨기를 바랍니다.
아~ 답변 정말 감사합니다~^^ facs가 활용도가 정말 많더라구요~ 아직 모르는 부분이 많지만 계속 공부해볼 생각입니다~^^