2010-08-24
org.kosen.entty.User@61cf4739
채유나(moiedna)
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궁금한 점이 있어 여쭤봅니다^^:
조금 생뚱맞는 질문일지는 모르나, 이제 막 qPCR를 배우고 있기에 이해해 주세요;;
사용하는 기기는 7900HT이며, SYBR green method로 qPCR을 하려고 합니다.
보고자 하는 유전자는 총 3가지입니다(duplicate 진행 시 총 260개 이상).
현재 실험은 급하고 시약은 다소 한정되어 있어서..
96well plate에서 반응 시, 꼭 50uL volume을 맞춰야 하는지 궁금합니다;;
조금만 volume조절을 해도 현재 남아있는 시약으로 실험이 가능한데,
50uL volume으로 실험 시 시약 부족의 문제가 생겼네요..
384well로 할 수 있는 상황이 아니라 부득이하게 volume 조절 문제를 여쭤봅니다;;
답변 부탁드립니다..
- PCR
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
최영욱님의 답변
2010-08-25- 0
>궁금한 점이 있어 여쭤봅니다^^: > >조금 생뚱맞는 질문일지는 모르나, 이제 막 qPCR를 배우고 있기에 이해해 주세요;; >사용하는 기기는 7900HT이며, SYBR green method로 qPCR을 하려고 합니다. >보고자 하는 유전자는 총 3가지입니다(duplicate 진행 시 총 260개 이상). >현재 실험은 급하고 시약은 다소 한정되어 있어서.. >96well plate에서 반응 시, 꼭 50uL volume을 맞춰야 하는지 궁금합니다;; >조금만 volume조절을 해도 현재 남아있는 시약으로 실험이 가능한데, >50uL volume으로 실험 시 시약 부족의 문제가 생겼네요.. >384well로 할 수 있는 상황이 아니라 부득이하게 volume 조절 문제를 여쭤봅니다;; >답변 부탁드립니다.. 굳이 reaction volume을 50 ul로 하시지 않으셔도 됩니다. pipetting error가 적으신 분이라면 20~25ul volume으로 하셔도 무방합니다. 단 기기의 calibration이 50 ul이하도 setting이 되어있는지 확인하시기 바랍니다. 20 ul이하는 pipetting error를 가만하면 비추입니다.
최영욱(hookki) 2010-08-25글쎄요... 20 ul가 routine하다고 하셔도 일반적인 RT-PCR에서의 밴드차이를 보는것과 real-time PCR을 하는데 있어서 약간의 pipetting error가 엄청난 bias를 가져오게 됩니다. house keeping gene으로 보정은 하겠지만 아주 잘하시는 분이 아니라면 25 ul정도가 무난하다고 생각됩니다만
김윤상(yskim124) 2010-08-26좋은 의견입니다. 제 경우는 20 ul로 해도 Ct number가 소숫점 2번째 자리까지 같게 나옵니다.
그리고, ABI Stepone plus는 20 ul를 default라고 하고 있습니다. 기계마다 optimization 좀 다르죠.
덧글 감사합니다. -
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이창묵님의 답변
2010-08-25- 0
96-well plate에 25ul X 3 wells로 총 75ul setup이 필요하니 그 양을 고려하셔야 합니다. 사실 애매한 발현의 경우에는 technical 반복이 3번에다 biological 반복이 3번이 되어야 확실한 통계값을 얻을 수 있습니다. real-time pcr은 재현성이 가장 큰 문제인데 반복이 유일한 방법 같더군요. 도움이 되시길.
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답변
김윤상님의 답변
2010-08-26- 0
hookki 님의 좋은 말씀에 갑자기 생각나서 덧글 아닌 답변으로 적습니다. hookki님의 말씀처럼, pipetting 이 제일 중요합니다. 처음 시작하신 분이니까, pipetting 연습을 많이 하셔야 합니다. 저는 master reaction mixture를 15 ul로 하고, 이 용량에 (샘플 숫자+2)를 곱한 만큼의 mixture를 준비합니다. 샘플은 5ul씩 넣습니다. 그리고, p20 피펫을 이용해서 well 에 로딩하는데, 우선 reaction mixture부터 먼저 넣고, 나중에 샘플을 넣습니다. reaction mixture을 넣을 때는 같은 용액을 여러 well에 나눠서 넣는 것이므로, 피펫 팁을 하나만 사용합니다. 용액을 well에 넣을 때, 피펫 버튼을 완전히 다 누르지 않고, 용액을 튜브로부터 다시 가져올 때 누르는 만큼만 누릅니다. 이렇게 하면, 피펫 팁에 들어있는 용액을 완전히 빼내는 것보다는 훨씬 variation 이 적게 됩니다. 물론, 샘플을 넣을 때는 팁에 들어있는 샘플용액 모두를 넣습니다. 말로 설명하자니, 조금 어렵네요. 도움이 되었기를 바랍니다.
Assay 종류마다 recommend 하는 용량이 다릅니다. 25 혹은 50 ul 를 추천하더군요.
7900HT에서 20 ul로 써 보신 분이 있는지 모르겠습니다.
저는 StepOne Plus를 쓰기 때문에 20 ul가 거의 routine 입니다만...