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지식나눔

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endothelial progenitor cells FACS

2010-09-01 org.kosen.entty.User@280680dc 장현희(petfrog)
  • 1
blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 하고 있는 것 공유해 주세요..
  • protocol
  • CD34
  • VEGFR-2
  • FACS
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답변 1
  • 답변

    김기환님의 답변

    2010-09-09
    • 0
    >blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. > >fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. >FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 >하고 있는 것 공유해 주세요.. 아래 staining dye는 human cell 염색 기준의 BD시약입니다 일반적으로 mouse cell에서 사용할 수 있는 dye 판매회사에서, 각 Ab의 희석 비율을 달리하고 있으므로, information sheet을 참고하여 사용하시면 됩니다 surface antigen 염색은 그다지 까다로운 편이 아니기 때문에, 서로 다른 dye 2종을 함께 동시에 staining 해도 무방합니다 washing은 약 3회 정도 진행하면 그다지 background에 영향을 주지는 않습니다 dye농도나 세포 수 등을 고려하여 진행하시면 됩니다 특히 cell viability가 중요하니 ice상에서 진행하세요 일반적으로 위와 같은 surface Ag staning은 live cell에서 바로 진행하는데 만약 fix가 필요한 경우에도 실험 순서는 동일합니다 단, fix시에는 세포 종류에 따라 너무 surface Ag의 단백질 구조에 영향을 주지 않는'적절한 고정용액의 종류와 농도를 구별하시면 됩니다 아래는 요청하신 대로 실험 순서 중심으로만 자료 올립니다 참고하세요 1. make the cell suspension (at least 2 × 105 cells) in 2058 or 2063 tubes (BD, 5ml) 2. add 20-50 λ of staining dye (FITC, PE…): total cell suspension is approximately within 100 λ 3. keep the tubes on ice for 15-20min 4. wash with FACS buffer 3x (depends) 5. re-suspend the cells in 0.5-1 ml of FACS buffer 6. analysis ※ if you have secondary antibody with Fluorophore-conjugated abtibody, then repeat step 2-4 for each first and secondary antibody ※ FACS buffer: 2 or 5% of FBS, PBS, 0.1% NaN3
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    >blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. > >fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. >FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 >하고 있는 것 공유해 주세요.. 아래 staining dye는 human cell 염색 기준의 BD시약입니다 일반적으로 mouse cell에서 사용할 수 있는 dye 판매회사에서, 각 Ab의 희석 비율을 달리하고 있으므로, information sheet을 참고하여 사용하시면 됩니다 surface antigen 염색은 그다지 까다로운 편이 아니기 때문에, 서로 다른 dye 2종을 함께 동시에 staining 해도 무방합니다 washing은 약 3회 정도 진행하면 그다지 background에 영향을 주지는 않습니다 dye농도나 세포 수 등을 고려하여 진행하시면 됩니다 특히 cell viability가 중요하니 ice상에서 진행하세요 일반적으로 위와 같은 surface Ag staning은 live cell에서 바로 진행하는데 만약 fix가 필요한 경우에도 실험 순서는 동일합니다 단, fix시에는 세포 종류에 따라 너무 surface Ag의 단백질 구조에 영향을 주지 않는'적절한 고정용액의 종류와 농도를 구별하시면 됩니다 아래는 요청하신 대로 실험 순서 중심으로만 자료 올립니다 참고하세요 1. make the cell suspension (at least 2 × 105 cells) in 2058 or 2063 tubes (BD, 5ml) 2. add 20-50 λ of staining dye (FITC, PE…): total cell suspension is approximately within 100 λ 3. keep the tubes on ice for 15-20min 4. wash with FACS buffer 3x (depends) 5. re-suspend the cells in 0.5-1 ml of FACS buffer 6. analysis ※ if you have secondary antibody with Fluorophore-conjugated abtibody, then repeat step 2-4 for each first and secondary antibody ※ FACS buffer: 2 or 5% of FBS, PBS, 0.1% NaN3
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