KOSEN 한인과학기술자네트워크

닫기

더 많은 혜택을 위해
로그인 하세요.

지식나눔

지식나눔

HPLC Chromtogram 해석

2010-12-27 org.kosen.entty.User@48d22e4e 이상욱(swlee9363)
  • 5

첨부파일

요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, 파일 두개를 첨부하였습니다. 1. Blk no buffer - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 2. Blk no injection - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. 이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. 1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. 그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. 제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. 안나오게 할 수 있는방법은 없을까요??
  • HPLC
  • Chromtogram 해석
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변! 
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변하기
답변 5
  • 답변

    조윤환님의 답변

    2010-12-28
    • 2
    전에 올려 주신 chromatogram에 비해 baseline이 많이 좋아 졌군요. 일단 blank의 baseline 문제는 대부분이 오염이 원인입니다. 다른 가능성으론 기계적인 문제가 있을 수 있겠습니다. 먼저 기계적인 문제점에 대해 말씀 드리면 펌프나 이동상 혼합기, 밸브 등이 정상적으로 작동하지 못해서 나타나는 경우 입니다. 이동상에 녹아 있는 용존산소 때문에 나타나는 경우도 있지만 그런 경우는 아닌 듯 합니다. 오염은 여러가지 오염원이 있겠으나 첨부해주신 chromatogram으로 볼 때 buffer의 문제로 보입니다. buffer가 문제라면 buffer를 만들 때 사용한 시약, 물(DW), 이동상 제조시 사용한 모든 용기 등을 의심해 보아야 합니다. dw사용시 baseline이 깨끗한 걸로 볼 때 물은 원인이 아니군요. 용기도 깨끗한 것을 사용하셨을 겁니다. 다만 잘 지나치는 부분 중 하나가 미생물 입니다. microbial contamination은 용기, 기구, 물, 시스템 전체에 걸쳐 문제를 일으킬 수 있지만 잘 인지할 수 없는 부분이기도 합니다. 때문에 미생물이 번식하지 않도록 각별히 신경쓰시는 것이 좋습니다. 가장 가능성 높은 부분은 시약 입니다. 다른 시약을 사용해보면 금방 알 수 있습니다. 모든 걸 다 점검했는데도 해결되지 않는다면 blank peak으로 처리하시는 방법 밖에는 해결책이 없습니다.
    답변수정
    전에 올려 주신 chromatogram에 비해 baseline이 많이 좋아 졌군요. 일단 blank의 baseline 문제는 대부분이 오염이 원인입니다. 다른 가능성으론 기계적인 문제가 있을 수 있겠습니다. 먼저 기계적인 문제점에 대해 말씀 드리면 펌프나 이동상 혼합기, 밸브 등이 정상적으로 작동하지 못해서 나타나는 경우 입니다. 이동상에 녹아 있는 용존산소 때문에 나타나는 경우도 있지만 그런 경우는 아닌 듯 합니다. 오염은 여러가지 오염원이 있겠으나 첨부해주신 chromatogram으로 볼 때 buffer의 문제로 보입니다. buffer가 문제라면 buffer를 만들 때 사용한 시약, 물(DW), 이동상 제조시 사용한 모든 용기 등을 의심해 보아야 합니다. dw사용시 baseline이 깨끗한 걸로 볼 때 물은 원인이 아니군요. 용기도 깨끗한 것을 사용하셨을 겁니다. 다만 잘 지나치는 부분 중 하나가 미생물 입니다. microbial contamination은 용기, 기구, 물, 시스템 전체에 걸쳐 문제를 일으킬 수 있지만 잘 인지할 수 없는 부분이기도 합니다. 때문에 미생물이 번식하지 않도록 각별히 신경쓰시는 것이 좋습니다. 가장 가능성 높은 부분은 시약 입니다. 다른 시약을 사용해보면 금방 알 수 있습니다. 모든 걸 다 점검했는데도 해결되지 않는다면 blank peak으로 처리하시는 방법 밖에는 해결책이 없습니다.
    등록된 댓글이 없습니다.
  • 답변

    이상후님의 답변

    2010-12-28
    • 0
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? Gradient를 주게 되면 흔히 일어나는 현상 같아 보입니다. 더구나 ACN과 buffer가 혼합됐을 때는 온도변화가 동반되게 됩니다. 이런 이유가 한가지 원인이 될 수 있고, gradient를 급격하게 주게 될 때도 앞서 언급한 물리적 현상으로 인하여 baseline이 불안정해 질 수 있습니다. Gradient의 비율을 너무 급격하게 주지 말고 단계적으로 주는 방법도 하나의 해결책이 될 수 있습니다.
    답변수정
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? Gradient를 주게 되면 흔히 일어나는 현상 같아 보입니다. 더구나 ACN과 buffer가 혼합됐을 때는 온도변화가 동반되게 됩니다. 이런 이유가 한가지 원인이 될 수 있고, gradient를 급격하게 주게 될 때도 앞서 언급한 물리적 현상으로 인하여 baseline이 불안정해 질 수 있습니다. Gradient의 비율을 너무 급격하게 주지 말고 단계적으로 주는 방법도 하나의 해결책이 될 수 있습니다.
    조윤환(brmdolee) 2010-12-28

    동감입니다. gradient ratio를 급격히 변화시킬 경우 펌프나 혼합기의 성능이 변화에 적절히 대응하지 못하는 상황이 연출될 수 있고, 결과적으로 그러한 결과가 나오게 됩니다.

  • 답변

    정재한님의 답변

    2010-12-28
    • 0
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? 버퍼와 이동상용매를 혼합을 해보셨나요? chromatogram을 보면 버퍼에 문제가 있는거 같아 보이네요 Gradient 조건이 어떻는지 잘 모르겠지만 peak이 나오는 시간대를 계산하셔서 이동상 용매와 혼합을 한번 해보세요 버퍼와 이동상용매의 충돌로 인해 peak이 잡힐수도 있거든요. 그리고 이동상 용매는 필터링해서 사용하셨겠죠? 15min peak만 잡으면 될것 같고, 다른시간대 peak은 baseline으로 잡으셔도 될것 같은데요.
    답변수정
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? 버퍼와 이동상용매를 혼합을 해보셨나요? chromatogram을 보면 버퍼에 문제가 있는거 같아 보이네요 Gradient 조건이 어떻는지 잘 모르겠지만 peak이 나오는 시간대를 계산하셔서 이동상 용매와 혼합을 한번 해보세요 버퍼와 이동상용매의 충돌로 인해 peak이 잡힐수도 있거든요. 그리고 이동상 용매는 필터링해서 사용하셨겠죠? 15min peak만 잡으면 될것 같고, 다른시간대 peak은 baseline으로 잡으셔도 될것 같은데요.
    이상욱(swlee9363) 2011-01-03

    처음 샘플을 녹일 때 main peak 가 나오는 혼합비율인 ACN : Buffer : Dioxane = 50 : 50 : 0.1로 섞어서 사용하였으며 ACN 에 녹기는하지만 소량의 Dioxane 을 넣었습니다.

  • 답변

    변성천님의 답변

    2010-12-31
    • 0
    기포에 의한 문제일 가능성 높습니다. 해당 사이트를 참조하세요 http://www.labplus.co.kr/tech/uploadHTML/rt_degas.htm >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요??
    답변수정
    기포에 의한 문제일 가능성 높습니다. 해당 사이트를 참조하세요 http://www.labplus.co.kr/tech/uploadHTML/rt_degas.htm >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요??
    등록된 댓글이 없습니다.
  • 답변

    정재한님의 답변

    2011-01-04
    • 0
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? 조건을 좀 더 상세히 말씀을 해주 실 수 있나요? 시간대 비율을 어떻게 하셨는지...윗 글처럼 degassing의 문제 가능성도 있구요. 혹시 기기 펌프가 binary pump 에요? 아님, Quaternary Pump 에요? 펌프의 성격에 따라 이동상 용매의 혼합차이가 생겨 불안정해지기도 하거든요 이동상용매를 필터링 (degassing)하시면 미세 버블과 이물질 제거가 되지만 어느 정도 남아있거든요 상대적으로 감압 degassing하실때 생길 수 있는 큰 버블은 기기 자체내에 degassing을 해주는 장치가 있는데 그 부분도 한번 점검을 해보세요
    답변수정
    >요 전에도 질문을 했었지만 다시한번 질문드립니다, > >파일 두개를 첨부하였습니다. > >1. Blk no buffer > - 이 data 는 ACN 과 DW로 Gradient 걸어서분석 > >2. Blk no injection > - 이 data 는 1번과 같은 Gradient조건으로 DW 대신 Buffer 를 사용. > >이때 buffer 는 10mM NH4HCO3 입니다. > >1번과 2번의 HPLC 조건은 Column, Column온도, Gradient 가 동일하며 >단지, 1번은 ACN : DW / 2번은 ACN : buffer 라는 것입니다. > >그리고 이 두 data 를 분석할때 아무 Solvent 도 Injection 하지 않았습니다. > >제가 궁금한것은, 2번의 datad에서 15min, 18min, 19min 에 나오는 Peak 를 >어떻게 이해해야할지 잘모르겠습니다. > >ACN과 DW 로 Column wash도 했는데 buffer만 있으면 이렇게 3 Peak 가 나옵니다. >Buffer 를 새로 만들어도 같은 RT 에서 확인이 됩니다. > > >안나오게 할 수 있는방법은 없을까요?? 조건을 좀 더 상세히 말씀을 해주 실 수 있나요? 시간대 비율을 어떻게 하셨는지...윗 글처럼 degassing의 문제 가능성도 있구요. 혹시 기기 펌프가 binary pump 에요? 아님, Quaternary Pump 에요? 펌프의 성격에 따라 이동상 용매의 혼합차이가 생겨 불안정해지기도 하거든요 이동상용매를 필터링 (degassing)하시면 미세 버블과 이물질 제거가 되지만 어느 정도 남아있거든요 상대적으로 감압 degassing하실때 생길 수 있는 큰 버블은 기기 자체내에 degassing을 해주는 장치가 있는데 그 부분도 한번 점검을 해보세요
    김종현(kimjh1879) 2011-01-04

    제 생각도, degassing의 문제와 buffer 오염문제가 제일 큰 의심부분이네요~
    특히나 dw시에는 baseline이 깨끗한걸봐서는, column 문제는 아닌거 같구요~
    그리고,salay 님 말씀대로 15min대만 잡으시면 나머진 peak는 baseline으로 잡으셔도 될것 같아요;;

목록
목록