2011-04-07
org.kosen.entty.User@28150649
이효지(koko7912)
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macrophage에서 autophagosome을 detection하고자 합니다.
Raw264.7 cell에서 AO로 stainning을, 다음과 같은 과정을 통해 수행하였습니다.
4% paraformaldehyde (10~15 min) fixation
1% H2O2 (10min) cell damage
PBS washing 2회 (5min)
70% ethanol fixation
AO 5 ug/ml (i PBS) (3~5 min)
PBS washing 2회 (5min)
mounting
그런데, LC3 stainning을 통해서는 autophagosome이 선명하게 보이는던 sample도 AO stainning을 통해 관찰했는데, 잘 보이지가 않습니다. control과 sample과 차이를 잘모르겠습니다. 그리고 AO 결과들을 보면 녹색과 붉은 색으로 나오는데, 득정 파장에서 각각 관찰을 하고 merge하는 건지, 아니면, 특정한 파장이 있는 것인지 궁금합니다. 또한 위에 protocol이 맞는지, 시간, 농도 등 조언부탁드립니다.
그리고 MDC stainning은 아직 한번도 시행해 보지 않은 실험입니다.
어떻게 하는 것인지,자세하게 조언부탁드립니다.
- autophagy
- acridine orange (AO)
- monodasylcadaverine (MDC)
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답변 1
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답변
김상태님의 답변
2011-04-13- 0
>macrophage에서 autophagosome을 detection하고자 합니다. > >Raw264.7 cell에서 AO로 stainning을, 다음과 같은 과정을 통해 수행하였습니다. > >4% paraformaldehyde (10~15 min) fixation >1% H2O2 (10min) cell damage >PBS washing 2회 (5min) >70% ethanol fixation >AO 5 ug/ml (i PBS) (3~5 min) >PBS washing 2회 (5min) >mounting > >그런데, LC3 stainning을 통해서는 autophagosome이 선명하게 보이는던 sample도 AO stainning을 통해 관찰했는데, 잘 보이지가 않습니다. control과 sample과 차이를 잘모르겠습니다. 그리고 AO 결과들을 보면 녹색과 붉은 색으로 나오는데, 득정 파장에서 각각 관찰을 하고 merge하는 건지, 아니면, 특정한 파장이 있는 것인지 궁금합니다. 또한 위에 protocol이 맞는지, 시간, 농도 등 조언부탁드립니다. > >그리고 MDC stainning은 아직 한번도 시행해 보지 않은 실험입니다. >어떻게 하는 것인지,자세하게 조언부탁드립니다. > > =ao는 세포가 정상시 녹색형광이 세포사멸 초기에는 오렌지색 후기에는 적색형광이 보임 그래서 EtBr/PI+AO로 염색하여 확인함 MDC는 AUTOPHAGY확인시 염색함 이는 세포자가포식시 주변부분이 산성이 되는 양상에서 확인됨