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luciferase assay로 활성테스트를 하는 석사과정생입니다.
다름이 아니고 최근에 promega사에서 나온느 dual glo luciferase assay kit을 구입하여
실험하고 있는데요....
처음 setting을 잡는 단계 입니다.
메뉴얼에 보면 quenching effet라고 해서 넣어주는 시약에 의해 firefly값이 소강되는 현상이
나타나기때문에 quenching effect에 대한 optimize를 해야한다는 내용이 있습니다.
아무리 봐도 무슨 내용인지 어떻게 해야하는지 왜 해야하는지에 대해서 알고 싶습니다.
고수님들의 깨알같은 조언부탁드립니다.
- dual glo luciferase
- quenching
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
장성재님의 답변
2011-09-27- 2
dual glo luciferase system은 reporter vector의 transfection efficiency에 의해서 발생할 수 있는 오차를 줄이기 위해서 vector 내부에 존재하는 Renillar luciferase를 internal control로 사용하여 target reporter gene인 Firefly luciferase 측정값을 보정하도록 설계된 시스템입니다.
따라서, single luciferase assay system에서와 같이 표적이 되는 Firefly luciferase의 활성을 측정한 후에 이를 quenching하여 제거한 후 internal control (실험군 세포에 도입된 vector의 양, 즉, transfection efficiency를 알 수 있는 기준 값으로 optimization이라고 표현함)로 Renillar luciferase의 활성을 측정하는 것 입니다. 그래야지만 reporter gene assay에서 transfection efficiency에 상관없이 promoter 활성을 갖는 특정 염기서열을 동정할 수 있는 것이지요.
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luciferase assay로 활성테스트를 하는 석사과정생입니다.
다름이 아니고 최근에 promega사에서 나온느 dual glo luciferase assay kit을 구입하여
실험하고 있는데요....
처음 setting을 잡는 단계 입니다.
메뉴얼에 보면 quenching effet라고 해서 넣어주는 시약에 의해 firefly값이 소강되는 현상이
나타나기때문에 quenching effect에 대한 optimize를 해야한다는 내용이 있습니다.
아무리 봐도 무슨 내용인지 어떻게 해야하는지 왜 해야하는지에 대해서 알고 싶습니다.
고수님들의 깨알같은 조언부탁드립니다. -
답변
이상후님의 답변
2011-09-27- 0
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luciferase assay로 활성테스트를 하는 석사과정생입니다.
다름이 아니고 최근에 promega사에서 나온느 dual glo luciferase assay kit을 구입하여
실험하고 있는데요....
처음 setting을 잡는 단계 입니다.
메뉴얼에 보면 quenching effet라고 해서 넣어주는 시약에 의해 firefly값이 소강되는 현상이
나타나기때문에 quenching effect에 대한 optimize를 해야한다는 내용이 있습니다.
아무리 봐도 무슨 내용인지 어떻게 해야하는지 왜 해야하는지에 대해서 알고 싶습니다.
고수님들의 깨알같은 조언부탁드립니다.Kit내에 sheet지를 읽어보시면 알겠지만 Renilla luciferase의 기질인 coelenterazine은 luciferase가 없어도 자동산화가 되는 효소-무관한 반응 즉, autoluminescence가 일어나게 됩니다. 실제로 assay할 때는 계면활성제가 높은 반응조건에서 할 때가 많이 있는데, 이런 조건들이 autoluminescence 강도를 증가시킬 수가 있는데 결국 검출 감도를 떨어뜨리는 역활을 하게 됩니다. 질문자께서 사용하는 dual-glo luciferase assay system내에 들어있는 특정 성분이 이런 autoluminescence를 감소시키는 역활(즉, quenching 역활)을 하게 됩니다. 따라서 실험전에 optimized autoluminescence를 mannual대로 진행하고 해야 원하는 만큼의 감도를 얻을 수가 있습니다.
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답변
황인성님의 답변
2011-09-28- 0
sjsjj님께서 잘 설명해주셨는데, 한 가지만 첨언하겠습니다.
Stop&Glo는 firefly luminescence를 10,000배 이상 quenching합니다. 따라서 일반적인 실험에서 firefly luc에 의한 luminescence를 측정한 후 이 신호를 없애고 internal standard인 Renilla luc에 의한 luminescence를 보고자 할 때, firefly luc의 luminescence 세기가 Renilla보다 100배 이상 강하다면 firefly luc의 신호가 1%이상 Renilla 신호로 흘러가게 됩니다. 예를 들어, firefly가 1,000,000 RLU이고, Renilla가 1,000 RLU라면(1,000배 차이) Stop&Glo 처리 후 firefly는 100 RLU가 되겠고 Renilla는 1,000 RLU가 되겠죠. 하지만 읽히는 값은 1,000 + 100 = 1,100로 약 10% 정도 오차가 생깁니다. 따라서 control reporter에 대한 promoter를 선택할 때 둘 사이의 luminescence 차이가 100배 미만이 되도록 최적화 해주는 것입니다.
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luciferase assay로 활성테스트를 하는 석사과정생입니다.
다름이 아니고 최근에 promega사에서 나온느 dual glo luciferase assay kit을 구입하여
실험하고 있는데요....
처음 setting을 잡는 단계 입니다.
메뉴얼에 보면 quenching effet라고 해서 넣어주는 시약에 의해 firefly값이 소강되는 현상이
나타나기때문에 quenching effect에 대한 optimize를 해야한다는 내용이 있습니다.
아무리 봐도 무슨 내용인지 어떻게 해야하는지 왜 해야하는지에 대해서 알고 싶습니다.
고수님들의 깨알같은 조언부탁드립니다.
김정환(mark1130) 2011-09-28답변 감사합니다. 많은 도움이 되었습니다. 죄송하지만 한가지만 더 여쭙겠습니다.
tinceo 님께서 말씀하신 내용을 제가 이해하기에는 최적작업을 하는데 있어서 plasmid의 양, 즉, firefly와 renilla가 발광하기 위한 plasmid를 transfection 할때 plasmid의 양적 측면에서 최적화를 하라는 말씀이신지요....
stop & glo reagent를 넣고 나서 시간에 따른 최적작업을 하면 안되는지요.....
가령 control 실험으로서 firefly가 발광하게끔하는 plasmid만 transfection을 하고 renilla 발광 plasmid는 transfection 시키지 않은 상태에서 실험하여 stop & glo reagent를 넣고 시간별로 측정해서 firelfy의 RLU값이 떨어지는 시간대를 잡는 방법은 어떨런지요...
황인성(tinceo) 2011-09-28아무래도 질문자님의 '최적화'라는 단어를 제가 잘못 짚었나 봅니다.^^ Plasmid 양이 달라도 normalize가 가능한 시스템이니 plasmid양을 이용해 최적화하는 것은 별 의미가 없습니다. 시간대별로 최적화 하는 것도 필요는 하겠지만 그리 중요한 요소는 아닙니다. Stop$Glo 넣어 주기 전에 luminescence가 떨어진 것을 확인하는 것은 순전히 '마음의 평화'를 위해서지요. 제가 말한 최적화는 다양한 reporter vector들 중에 본인의 실험에 맞는 promoter를 찾아내야 하는 것을 의미합니다(대개는 아주 드문 운이 없을 경우겠지만).
Optimized autoluminescence에 대한 것이라면, Dual Glo 시스템에 이용되는 시약은 autoluminescence를 줄이도록 최적화 되어 판매되고 있으니 그냥 쓰시면 됩니다. 매뉴얼 대로 한번 주욱 가보시는 게 시스템을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
답변감사합니다 많은 도움이 되었습니다.