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형광분석법의 원리는 특정 샘플에서 발광(emission)되는 빛을 이용하여 분석하는 방법인데, 특정

화합물의 분자들 안에 있는 전자들이 자외선이나 가시광선과 같은 빛을 흡수하여 들뜬상태(exited

state)가 되고, 이 들뜬 전자들이 다시 바닥상태(ground state)로 되돌아 갈 때 특정화합물의 분자

들이 빛을 방출하는 경우를 형광이라고 합니다. 따라서 형광분석법은 이 형광의 양을 측정하게 됩

니다. 수용액에 있어서 들뜬상태의 수명은 10^-9초 정도인데 이 시간 동안에 내부 진동과 같은 이유

로 에너지의 손실이 발생하므로 형광의 파장은 항상 흡수되는 빛의 파장보다 길게 됩니다. 형광물

질이 방출하는 형광의 강도는 시료 중의 형광물질의 농도가 높을수록 강하기 때문에 이러한 현상

을 이용하여 시료 중의 형광물질을 정량분석할 수 있게 됩니다. 이 방법은 흡광광도법에 비하여 감

도가 높으며, 형광을 내지 않는 분자종이 비교적 한정되어 있으므로 목적하는 성분을 선택적으로

검출 할 수 있습니다.

샘플 용액의 형광광도는 시료 중의 형광물질 농도에 비례하는데 다음과 같이 식으로 나타낼 수 있는데,
            F = KC  (F: 형광강도, K: 비례상수, C: 형광물질의 농도)

여기서 비례상수 K에 영향을 미치는 요인들은 흡광도, 흡수광의 강도, 물질고유의 몰 흡광계수, 빛

의 통과 길이, 그리고 양자수율(quantum efficiency)등이 있습니다. 그러므로 표준시료를 이용하

여 검량선을 작성하고 시료의 형광강도를 측정하면 시료 중의 형광물질의 농도를 결정할 수 있습

니다. 아울러 양자수율과 형광강도에 영향을 주는 중요한 요인은 형광물질 분자의 전자구조와 소

광(quenching) 현상인데, 전자들의 에너지 상태의 변화로 형광이 방출되기 때문에 분자의 전자구

조가 그 분자의 형광성을 결정하게 됩니다.

예를 들면 -NH2, -OH등은 양자수율을 증가시키고 -COOH, -NO2, -N=N- 등은 형광의 강도를 약

화시키는데, 형광의 강도를 결정하는 또 하나의 요인은 소광현상인데, 소광이란 시료 용액 중에 존

재하는 어떤 화학종에 의하여 형광이 소실되는 현상을 말하며, 이 현상은 다음과 같이 몇가지 원인

에 의해서 발생될 수 있습니다. 시료 용액 pH는 형광물질의 분자구조를 변화시킬 수 있기 때문에

소광의 원인이 될 수 있습니다. 즉 시료 용액의 조제시 사용된 용매도 형광강도에 크게 영향을 미

치는데, 예를 들어서 nucleotide들은 낮은 pH에서는 형광을 나타내지만 생리적 pH에서는 형광을

나타내지 않습니다. 시료 용액의 조제시 사용된 용매도 형광강도에 크게 영향을 미치는데, 극성이

큰 용매일수록 분자들의 들뜬상태가 안정하기 때문에 극성이 큰 용매 중에 있을수록 형광 파장은

길어지게 되어서, 물과 같은 극성 용매에서 양자수율이 낮아지는 경우가 많습니다. 그리고 용매의

점도가 높을수록 양자수율이 높아지게 됩니다. 또한 시료의 온도도 형광강도에 영향을 미치는데

온도가 높아질수록 형광강도가 작아지는 경향을 나타냅니다. 그 이유는 고온이 되면 분자들은 충

돌로 인하여 소광이 일어나기 쉽기 때문입니다. 또한 요오드와 같은 무거운 원자들은 강력한 형광

광제이기 때문에 형광분석법에 사용하지 않아야 하며 산소 또한 강력한 광소제이므로 산소의 농도

가 달라지면 형광측정에 오차가 발생할 수 있습니다. 더 자세한 내용은 첨부 파일 참고하세요!!

도움이 되시길 바랍니다.