2012-05-31
org.kosen.entty.User@4270f26e
신지욱(skson1101)
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안녕하세요, 선배님
저는 Itraconazole을 이용해서, 약물의 가용화 실험을 진행하고 있는 학생입니다.
다름이 아니라, Itraconazole의 HPLC 분석 방법에 대하여 여쭤보고자 글을 작성하였습니
다.
선행 Itraconazole 논문들에서 찾아본 HPLC 조건은
(이동상 조건 80:20 (v/v) mixture of acetonitrile and 0.1% diethylamine)
(유속 1.2ml/min, 20ul injection)
(Standard solution은 50mg ITZ를 500mL methanol에 녹여, 100ppm, 50, 25,....)
이렇게 진행을 하였습니다.
제조한 ITZ formulation의 경우 위액(pH 1.2)에서 하루 동안 water bath에 놓아서,
용해 평형을 이룬 다음에, 상층액을 필터링한 후에, 바로 HPLC sample vial에 담아 inj
ection하여서 각 formulation에서의 ITZ 가용화 정도를 측정하고자 하였습니다.
첫번째 질문은, 제가 듣기로는 LC 분석 조건의 기본 원리가 측정 샘플(검액), 검량선 샘
플(표준액) 들을 동일한 이동상으로 녹여서, LC 흡광도를 측정하는 것이라 들었습니다
그런데, 상기 이동상 조건으로는, ITZ를 녹이지 못하는 것을 확인하였고,
상기 논문에서도 검량선을 만들때 이동상이 아닌, 메탄올로 녹였는데, 이렇게 진행해도 되
는 것인지 궁금합니다. (검액, 표준액을 동일액으로 희석하지 않으면 흡광도에 차이가 나
서 LC가 정확하지 않다고 들어서, 이렇게 진행해도 되는지 여쭤보고 싶습니다)
둘째 질문은, 위쪽의 가용화 측정 방법에서, 저는 상층액을 필터링 한 후에,
1)이동상으로 희석 해보았으나, 필터링한 상층액이 이동상과 만나면서 다시 뿌옇게 되는 것을 확인하여, 이동상으로 희석하면 안되겟다고 생각하였고
2)그래서 필터링한 상층액을 따로 희석하지 않고 -> 바로 LC sample vial에 넣어 injection 하였습니다. (이렇게 진행해도 되는지 여쭤보고 싶습니다.)
(이게 아니라면 필터링한 상층액을(표준액을 희석할 때 쓴 메탄올처럼) Methanol을 이용해서 희석하고, 이를 Injection 해야하는지요?)
선배님, 이동상에 녹지 않는 약물을 분석할때는, 표준액, 검액을 어떤 식으로 제조하고, 분석을 해야하는 것인지 알려주시면 감사드리겠습니다. 부탁드립니다~ ^ - ^ ~
- HPLC
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
강광철님의 답변
2012-05-31- 0
첨부파일
1)대부분 MeOH에 녹여서 검량선 잡고 r2값이 0.99 이상의 직선이 나오면 문안하게 사용해도 될것같네요.. 2)은 농도에따라서 MeOH로 희석하던지 농도가 낮으면 바로 인첵해도 될것 같아요.. -
답변
조윤환님의 답변
2012-06-01- 0
HPLC를 이용해 제제의 가용화도를 측정하는 것은 매우 일반적인 방법입니다. 질문을 정리해가면서 질문마다 답변을 달아 보겠습니다. 1. 표준액은 메탄올로, 검액은 pH 1.2 완충액으로 각각 다른 용매로 녹여 제조해서 측정했는데 괜챦은가? ==> 괜챦습니다. 하지만 HPLC 측정시 이동상에 녹이는 것이 정석입니다. 이는 이동상에 녹여 측정할 때 가장 좋은 크로마토그램을 얻을 수 있기 때문입니다. 하지만 님이 경험했듯이 이동상에 녹지 않는 경우가 발생하므로 적절히 희석하는 방법을 사용합니다. 표준액의 경우도 메탄올로 고농도 stock solution을 제조한 후 이를 2~3회에 걸쳐 이동상에 희석해서 원하는 농도로 제조하는 것이 보통입니다. 이렇게 하면 메탄올로 인한 문제도 예방할 수 있고, 희석과정에서 용액제조시 발생할 수 있는 실험오차도 줄일 수 있습니다. 보통 편의성 때문에 아세토니트릴이나 메탄올에 그대로 검체를 녹여 HPLC를 측정하는 경우가 있는데.... 이는 피크의 형태에 부정적인 영향을 미치는 경우가 많습니다. 피크의 형태가 나빠지면 면적값이 부정확해지거나 분리도가 나빠지게 됩니다. 검액도 마찬가지로 이동상에 적절히 희석해서 측정하시기 바랍니다. 희석방법(희석배수)이 매우 중요합니다. 희석시 뿌옇게 변하는 것은 이트라코나졸이 석출하는 것일 수도 있겠으나 가능성은 적어 보입니다. 오히려 완충액 제조시 사용한 염이나 부형제가 석출하는 것일 수 있습니다. 비슷한 사례들을 찾아 참고하시면 좋겠군요. 측정전에 반듯이 시린지 필터를 이용해 여과해서 측정하시길 권합니다. 2. 두번째 질문은 첫번째 질문에 답하면서 어느 정도 답변이 된 것 같습니다. 제 생각에 검액을 그대로 측정하셨다면 아마 HPLC 피크가 꽤 크게 나왔을 것 같습니다. 만약 뿌옇게 변하는 원인이 약물의 석출이라면 너무 낮은 희석배수를 사용하셨을 거라고 예상됩니다. 농도 측정이 가능하면서 가능한 많이 희석한다면 이러한 문제는 피할 수 있으리라 생각합니다.
선배님, 그러면 사용하는 이동상과, 검액이나 표준액을 희석하는 용액이 달라도, HPLC 해도 괜찮은 것인지요. (이동상과 희석액이 달라지면 흡광도가 달라져서 피크 면적이 달라진다고 들어서, 이부분에 대해서 설명해주시면 감사드리겠습니다.)