KOSEN 한인과학기술자네트워크

안녕하세요 HPLC Column을 안정화하시는 중에 압력이 3500 psi정도로 높아졌다고 하셨는데요.. 용매를 여과하셨고, 공기도 최대한 제거하셨는데도 그런 것을 보면.. 제 경험상 컬럼이 어떤 물질에 의하여 오염된 것 같습니다. 그 물질은 salt일 수도 있고 소수성 물질일 수도 있습니다. 만약에 reverse-phase HPLC column을 이용하신다면 아래와 같은 방법으로 세척을 해보세요. (reverse-phase column이 아니라면 다른 방법을 이용하셔야 합니다.) 1. 컬럼 부피의 10배 정도의 water만을 흘려줍니다(salt 제거). 이때의 유속은 0.2 ml/min 정도를 이용해보세요. 만약에 압력이 3500 psi정도로 높다면 더 낮은 유속을 이용해도 됩니다. 2. 컬럼 부피의 10배 정도의 50% Methanol을 흘려줍니다. 3. 컬럼 부피의 10배 정도의 100% Methanol을 흘려줍니다. 4. 컬럼 부피의 10배 정도의 100% Acetonitrile을 흘려줍니다(소수성 물질 제거). 5. 컬럼 부피의 10배 정도의 100% Methanol을 흘려줍니다. 6. 컬럼 부피의 10배 정도의 50% Methanol을 흘려줍니다. 이렇게 해보시고도 압력이 떨어지지 않는다면 컬럼 외의 다른 문제가 있는 것으로서 해당 HPLC 업체에 연락하시면 더 확실한 도움을 받으실 수 있을 것 같습니다.

사용한 이동상을 제대로 여과하지 않았거나 시료 전처리가 미흡한 경우에는 컬럼이 오염될 수 있으며 튜빙이 막힐 수 있음. 또한 이동상으로 buffer를 사용한 후 물로 충분히 세척하지 않았다면 컬럼과 튜빙이 쉽게 막혀 시스템 압력이 높아질 수 있으며 pump head내의 seal 및 injector내의 seal이 쉽게 마모되어 시스템에서 용액이 새는 등 심각한 문제를 가져올 수 있음. 그러나 이런 경우 외에도 이동상 전환이 이루어지지 않은 경우에 시스템 압력이 높아질 수 있음. 서로 섞이지 않는 이동상을 사용하게 되면 컬럼에도 심각한 영향을 미쳐 컬럼을 사용하지 못하게 될 수 있음. 이동상의 섞임성은 Misibility No.의 차이로 확인할 수 있는데 No 차이가 15이상인 경우에는 서로 섞이지 않음. 만일 Buffer를 사용하다가 Hexane으로 이동상을 전환하려고 한다면 중간극성의 용매 사용으로 용매의 전환이 이루어진 후에 시스템을 사용해야 한다. 즉 Buffer - H2O - CH3CN - THF - Hexane 순으로 이동상의 전환이 이루어지도록 해야 한다.

HPLC 사용시 압력이 상승할 경우 압력 상승의 원인 파악이 가장 중요 합니다. 다른 분들의 답변들 처럼 앞서 사용한 용매가 완전히 제거되지 않아서 나타나는 현상일 수도 있고, 컬럼이 오염되어서 나타나는 현상일 수도 있습니다. 물론 그 밖에 원인 때문일 수도 있죠. 때문에 원인을 파악하는 것이 가장 중요하다는 것입니다. 일반적으로 4.6 x 5um x 150~250 mm C18 컬럼으로 물:메탄올 = 50 : 50 이동상을 1mL/min 정도로 흘리면 2400~3000 정도의 압력이 걸립니다. 물론 컬럼의 온도와 길이 및 상태에 따라 다소 차이가 있습니다. 컬럼세척 목적으로 행한 것이라면 님께서 사용하신 이동상은 권장하고 싶지는 않습니다. 물+메탄올 혼합액의 점도가 가장 높은 비율이기 때문입니다. 당연히 압력도 높아지고요. 이러한 사실을 기준으로 볼 때 님의 HPLC는 다소 압력이 높게 나타나고 있는 것이 사실입니다. 물론 평소와 압력이 확연한 차이를 나타냈기 때문에 발견했을 겁니다. 용매의 degassing이나 기기의 상태 등을 이미 점검하여 정상이라고 말씀하시는 것으로 봐선 이미 물 또는 메탄올 단일 용매를 흘려서 기기의 상태와 압력을 확인하신 것으로 보입니다. 이는 앞서 답변하신 분들이 예측하신 원인 때문에 압력이 증가한 것이 아닐 가능성이 높다는 것을 뜻합니다. 가장 좋은 방법은 안정화시 사용할 이동상을 흘리면서 연결부위를 하나씩 해체해서 원인을 파악하는 겁니다.제일 먼저 검출기 outlet, 검출기 inlet, 컬럼 outlet, 컬럼 inlet.......pump outlet까지 순차적으로 연결 fitting을 펌프쪽으로 순차적으로 거슬러 올라가며 풀어서 압력이 떨어지는 위치를 확인하는 겁니다. fitting을 풀었을 때 압력이 갑자기 확 떨어지는 위치 앞쪽이 문제가 발생한 곳이죠. 다른 분들이 지적하신 문제가 발생하려면 대부분 컬럼에서 문제가 발생해야 합니다. 컬럼이 원인이 아니라면 몇가지 가능성을 생각해볼 수 있습니다. 1. heater에 문제가 발생한 경우 - 이동상 점도 상승으로 압력이 상승할 수 있음. 2. pre-mixer에 문제가 발생한 경우 - 물과 메탄올을 각기 다른 용매병에 담아 놓고 pre-mixer를 사용해서 원하는 용매비율을 만들어 사용하는 경우 pre-mixer가 제대로 작동하지 않는 경우 3. pre-mixer가 없는 시스템의 경우 메탄올과 물을 각각 degassing 한 후 혼합해서 그대로 사용한 경우 - 각각의 용매는 degassing 했지만 혼합하면 mixing heat 때문에 bubble이 발생될 수 있으므로 혼합한 용매를 degassing해서 사용해야 합니다. 1~2번이 원인일 경우 엔지니어의 도움을 받으셔야하지만, 만약 3번의 경우라면 잘못된 solvent handling이 문제이므로 쉽게 바로 잡을 수 있을 겁니다.