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UF를 이용한 정제와 관련해서 궁금한것이 있습니다.
미생물을 배양하여 cell을 제거한 배양액속에 330 mw정도의 cofactor를 정제하려고하는데요.
DEAE resin을 이용해서 정제를 시도 했으나 배양액 속에 단백질이 너무많아서 정제에 어려움이 있습니다.
배양액상태에서 정제하려는 ~cofactor는 불안정한 상태이구요 .
DEAE resin을 통과한 cofactor를 포함한 faction을 uf하여 단백질을 제거 하고자 하는데
5K UF를 사용할 경우 UF를 통과한 액과 통과하지 못한 액 모두에서 cofactor가 검출됩니다.
UF 사용이 미숙해서 저런결과가 나타난건지. 아니면 UF가 5K이상의 단백질을 농축시켜 주면서 cofactor도 같이 통과시키는 걸까요 ? (단백질랑 붙어 있으면... )
혹시 아시는 분 답변 부탁드려요.
다른방법으로라도 정제를 쉽게 할수 있는 방법있으시면 알려주세요 ~^^
- UF
- 정제
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
이배훈님의 답변
2014-04-15- 1
cofactor 330 mw 아주 작은 분자량을 정제?
통상적으로 UF 5k의 사용은 분자량 15k-30k 분자량 또는 그이상 분자량을 가진 물질을 농축시킬때 사용합니다.. cofactor 330 mw ?은 너무 작은 분자량이라 UF 5k를 통과합니다.
UF를 통과하지 못한 용액에서 cofactor이 발견되었다는 것은 희석용액을 더 많이 써야한다는 것입니다.
희석용액을 더 많이 여러 번 쓰게되면 UF를 통과하지 못한 용액에서 cofactor의 농도가 점점차로 줄어들 것입니다.
이배훈(lbh217) 2014-08-27？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ 1？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？? ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？.
Dextran sulphate？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ PEG-OH ？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？ ？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?? ？？？？？？？？??？？？？？？？？. -
답변
이호진님의 답변
2014-04-16- 1
모르겠지만.. 앞서 답변하신 분의 말씀대로 저분자 인것 같네요.
미생물이 만들어내는 천연 물질을 분리하려는 것인가 봅니다.
어째든, UF 5K는 이론상으로 5K 보다 적은 분자량을 가진 것들을 걸려냅니다. 회사에 따라, 약간의 차이를 보이기도 합니다. 불량이 있기도 하구요.
cofactor가 열에 안정하면, 세포 배양물을 50도 정도에서 몇 분 동안 놔둬서 단백질 변성을 일으키는 방법이 있습니다. 단백질이 침전이 일어나면, centrifuge해서 침전물은 버리고, 용액 상에 있는 것을 원하는 물질일 수 있습니다.
방지훈(haru9900) 2014-07-17？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？??？？？？. oofactor？？？？？？？？ PQQ？？？？??？？？？. ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？?？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？ pH ？？？？？？？？? ？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？ ？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？, ？？？？?？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？ ？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？ ？？？？?？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？?？？？？？？？？？？？？ ？？？？??？？？？？？？？？？？？. ？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？ ？？？？？？？？？？？？？？？？?？？？？ ？？？？?？？？？？？？？?？？？？.
이호진(hjinlab) 2014-07-173.3. PQQ Purification
The medium was applied to a DEAE Sepharose F.F. anion-exchange column at a flow rate of 1 mL/min after centrifugation for 30 min at 2500 g, 4 ？？？？？？？？C. The column was equilibrated with 20 mM sodium citrate buffer, pH 5.5. PQQ was eluted from the column using 20 mM sodium citrate buffer, 1.0 M NaCl, pH 5.5. The fractions containing PQQ were pooled to one fourth volume for further purification by rotary evaporation. The pooled solution was crystallized at 4 ？？？？？？？？C overnight and the collected crystalline was further recrystallized. The final crystalline was dissolved with a 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) and saved for HPLC analysis.
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답변
성학모님의 답변
2014-04-23- 0
첨부파일
컬럼정제의 출발물질은 단백농도에 따라 전처리 여부를 고려해야 합니다.
목적하는 단백질의 분자량이 작으므로 적절한 침전법을 사용하고 컬럼정제하는 것이 적절하다고 봅니다. UF를 적용할 경우 단백량이 많은 상태에서는 부하를 많이 받아 정제효율 및 공정효율이 좋지 못할 수 있습니다.
1. 침전후 컬럼정제: 이온크로마토그래피
침전제로서는 0.1~1.0M citrate, ammounium sulfate, 0.5~2M glycine, alchol, TCA, PEG침전법 등이 있으므로 cofactor의 활성에 영향을 주지않으며, 타단백이 효과적으로 제거되는 침전제 및 침전조건을 찾아야 합니다. 1차적으로는 발표된 논문을 참고하는 것이 보다 쉬운 접근이라고 봅니다.
2. Quick 정제: 면역친화성 크로마토그래피
cofactor의 항체를 제작할 수 있다면 이를 레진에 고정화시켜 배양액을 직접적으로 로팅하여 정제할수 있습니다.
* 유의사항
열변성의 경우 대부분의 단백질에 부정적인 영향을 주므로 연구단계이든 생산단계이든 공정관리 및 품질관리에 호조건이라고 볼수 없습니다.
보다 자세한 내용이 필요하시나요. 메모남겨주세요.
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