2014-10-30
org.kosen.entty.User@37142154
홍성길(hong1111)
- 4
안녕하세요.
이번에 실험을 하면서 250kDa와 60kDa의 Protein을 conjugation 시킬려고 합니다.
Protein의 크기는 대략 1000 kDa 이하가 되게 하려고 합니다.
Conjugation이 되었는지 확인하기 위해 Native PAGE를 사용하려고 하는데, 경험이 전혀 없어서 문의 드립니다.
1. SDS-PAGE의 경우, xx kDa ~ xx kDa 의 경우는 xx %의 Gel을 써라... 이런 자료가 많은데, Native-PAGE는 찾기가 힘드네요.. 200~1000kDa의 protein에 적합한 Native PAGE gel 농도에 관한 자료가 있을런지요?
2. 저희 연구실에 SDS-PAGE에 사용한 장비가 있는데, GEL의 크기가 세로8cm,가로 10cm정도가 되야 딱 맞더라구요.. 그런데 시중에 판매하는 precast gel 중에 세로 8cm, 가로 8cm 인것이 잇는데, 이걸 그냥 사용하면 크게 문제가 되나요?
3. 아래 표를 보시면... 제품이 다르긴 하지만... Gel %가 비슷한 경우에, SDS-PAGE와 Native-PAGE의 separation range가 크게 다르네요... 제품이 달라서 그런가요? 아니면, 같은 GEL을 써도 SDS-PAGE와 Native-PAGE의 separation range가 원래 다른가요?
이쪽으로는 문외한이라... 바쁘시겠지만, 작은 조언도 큰 도움이 될것 같습니다.
감사합니다.
2. SDS-PAGE의
이번에 실험을 하면서 250kDa와 60kDa의 Protein을 conjugation 시킬려고 합니다.
Protein의 크기는 대략 1000 kDa 이하가 되게 하려고 합니다.
Conjugation이 되었는지 확인하기 위해 Native PAGE를 사용하려고 하는데, 경험이 전혀 없어서 문의 드립니다.
1. SDS-PAGE의 경우, xx kDa ~ xx kDa 의 경우는 xx %의 Gel을 써라... 이런 자료가 많은데, Native-PAGE는 찾기가 힘드네요.. 200~1000kDa의 protein에 적합한 Native PAGE gel 농도에 관한 자료가 있을런지요?
2. 저희 연구실에 SDS-PAGE에 사용한 장비가 있는데, GEL의 크기가 세로8cm,가로 10cm정도가 되야 딱 맞더라구요.. 그런데 시중에 판매하는 precast gel 중에 세로 8cm, 가로 8cm 인것이 잇는데, 이걸 그냥 사용하면 크게 문제가 되나요?
3. 아래 표를 보시면... 제품이 다르긴 하지만... Gel %가 비슷한 경우에, SDS-PAGE와 Native-PAGE의 separation range가 크게 다르네요... 제품이 달라서 그런가요? 아니면, 같은 GEL을 써도 SDS-PAGE와 Native-PAGE의 separation range가 원래 다른가요?
이쪽으로는 문외한이라... 바쁘시겠지만, 작은 조언도 큰 도움이 될것 같습니다.
감사합니다.
2. SDS-PAGE의
- Native Page
- PAGE
- GEL
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
김상태님의 답변
2014-11-03- 1
안녕하세요
선생님의 연구과정에서 합성을 conjugated한것으로 아는데 우선 uv spec으로 확인하여서
단백질의 양이 증가되었는지 FT-IR으로 구조가 변형되엇는지 어느부분에 기능기가 부착한것인지 확인후 SDS-PAGE 는 전하를 제거한 상태라 어느정도 분자량의 대략250KD이하에서 분리할목적이고 NATIVE GEL은 그렇지 않아 순수한 분자량 그대로 나타나지요
아마도 NATIVE GEL을 사용하야 하겠네여 -
답변
신현용님의 답변
2014-11-03- 1
1. 네이티브 젤의 농도는 단백질의 분자량/크기와 관련있습니다. 젤의 농도(bis-acryl amide)는 10-8%정도가 적당할 듯합니다. 두 단백질의 반응을 확인할 수 있을 겁니다. 두개의 단백질의 크기가 우선 차이가 크기 때문에 8-12% 가 가능하지만 네이티브 전기영동의 특성상 SDS에 비해 한등급 낮은 젤을 사용하시길 바랍니다.
2. 그리고, 젤과 카셋트의 크기가 다르면 젤이 채워지지 않는 부분으로 대부분의 전하가 흐르기 때문에 전기영동이 잘 되지 않습니다. 젤 만드는 것 어렵지 않으니, 경험도 할겸 만들어 보시길 바랍니다.
**네이티브 젤의 전기 영동시 처음에 전하를 SDS처럼 높이면 단백질 손상이 많으니, 낮은 전하부터 사용가길 바랍니다. -
답변
김성훈님의 답변
2014-11-04- 1
"250kDa와 60kDa의 Protein을 conjugation 시킬려고 합니다.
Protein의 크기는 대략 1000 kDa 이하가 되게 하려고 합니다."
이라고 문의 하셨는데..Native gel을 써서 해당 크기의 단백질을 분리해서 보는 것은 쉬운 일이 아니죠. 실제적으로 단백질 실험을 많이 해본 사람들은 경험적으로 250 kDa과 같이 큰 단백질은 아크릴아마이드 조성을 상당히 낮춘다하더라도 젤상에서 단백질이 거의 상단에 위치하는 것을 볼 수 있을 겁니다. 그리고 젤이 흐물거려서 핸들링 하는 것도 아마 쉽지 않을 겁니다.
원하시는 컨쥬게이션으로 1000 kDa, 즉 1 MDa의 단백질을 확인하려면 제 개인적인 생각으로 size exclusion chromatography를 쓰면 미반응한 250 kDa과 60 kDa을 확인하는게 가장 좋을 것 같은데 그게 안된다면..Blue Native Gel을 쓰시는게 대안인 것 같습니다.
예전에 만들어 썼는데..요즘 보니 상품으로 아예 나오네요.Novex® NativePAGE™ Bis-Tris gel system
Life Technology 선전하는 것은 아니지만
사다가 프로토콜에 있는대로 gel running을 해주면 됩니다.
도움 되셨길..
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답변
최명락님의 답변
2014-11-04- 1
1. 문의하신 Native-PAGE가 SDS-PAGE 진행시에 SDS를 빼고 진행하는 방법을 말씀하시는 건지 궁금합니다. 만약 맞다면, Native-PAGE와 SDS-PAGE의 gel 농도는 큰 차이를 두시지 않고 진행하셔도 됩니다. 일반적으로 gel을 직접 제조하셔서 SDS-PAGE를 진행하시는 경우, gel의 내부에 기포가 발생하는 경우가 있습니다. gel화 되기전 액체상태에서 기포가 발생하였을 때 이를 제거해주지 않으면 gel화 후 gel 내부에 구멍이 생기게 됩니다. 이러한 현상은 실제로 실험을 진행해보시면 종종 발생하는데, 그 이유는 gel 용액에 첨가한 SDS 때문입니다 (기포의 발생을 촉매함). 그러므로 gel 용액 제조시 SDS의 첨가를 생략해서 진행하는 경우가 실제로 많습니다. 결론적으로, SDS/Nagative-PAGE 진행시 gel 농도의 차이는 크게 고려하지 않으셔도 됩니다.
2. SDS-PAGE kit의 호환성에 관련된 문제입니다.
일반적으로, 현재 사용하고 계시는 kit가 gel을 직접 제조하여 SDS-PAGE를 진행하는 제품이면 gel의 크기는 큰 문제가 되지 않으실겁니다. 하지만, 문의사항을 보니 완성품gel을 구입하여 사용하시는 것으로 보입니다. 이럴 경우는 gel의 크기가 달라지면 gel에 골고루 전압이 가해지지 않을 가능성이 높기 때문에 추천해드리고싶지 않습니다.
3. 첨부하신 표는 이것만 봐서는 확실하지 않으나, 회사에서 판매하는 표준시약(standards)의 측정가능한 범위를 나타낸 것으로 보입니다. 이는 제품의 분자량 확인 특성을 gel의 농도와 관련해서 표시해 준 것이기 때문에, 실험자분께서 측정하고자 하는 단백질의 분자량과, 그에 맞는 gel의 농도를 다 파악하셨다면 그에 맞는 표준시약을 구입하고자 할 때 참고하시면 됩니다. 제가 SDS-PAGE를 진행하면서 사용했던 표준물질에 해당하는 사항을 아래에 적어보겠습니다.
- Prestained SDS-PAGE standards, Low Range, Bio-rad, 161-0305
103,035 Da ~ 19,445 Da까지 총 6개의 표준물질이 함유되어 있습니다. 실험 준비 하시면서 Bio-rad 홈페이지에 방문하시면 분자량 범위별로 표준물질을 선택하실 수 있습니다. 실험 조건에 맞는 표준물질을 선택하시면 됩니다.