2016-09-27
org.kosen.entty.User@1dd1f8c1
김주혁(kjh5703)
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-제가 virus RNA를 RT-PCR(random primer, oligo dT를 이용했습니다.)해서
forward primer, reverse primer를 사용해서 PCR을 하는데
Forward는 제가 제작하고 reverse를 RNA end sequence와 oligo-dT 2 종류로 해서
PCR을 했습니다.. 그런데 안 나타나네요..예상 size는 800bp인데 non-specific위주로 나타납니다.
거의 수십 kb의 sequence 중 마지막 end sequence 500bp 정도만 안나타납니다..
부디 도움을 주세요.. ㅠㅠ
forward primer, reverse primer를 사용해서 PCR을 하는데
Forward는 제가 제작하고 reverse를 RNA end sequence와 oligo-dT 2 종류로 해서
PCR을 했습니다.. 그런데 안 나타나네요..예상 size는 800bp인데 non-specific위주로 나타납니다.
거의 수십 kb의 sequence 중 마지막 end sequence 500bp 정도만 안나타납니다..
부디 도움을 주세요.. ㅠㅠ
- PCR
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2016-09-28- 1
RT-PCR하실 때 각각 random primer와 oligo-dT 모두 사용하셨는데, 이 2가지 cDNA 모두에서 님이 원하시는 밴드를 얻지 못하셨다는 말인가요?
PCR 하실 때 왜 forward만 본인이 제작을 하시고 reverse는 RNA end sequence(?? 뭐죠?)와 oligo-dT를 사용하셨는지???
기본적으로 target gene의 full sequence를 알고 계신다면 forward, reverse 모두 제작하셔서 사용하시면 될텐데....
target의 사이즈가 작아서 손쉽게 단일한 밴드를 얻으실 수 있을 것 같은데...
Primer 디자인에서부터 polymerase 선택 등 스텝 하나하나 다시 검토하셔야 할 듯합니다. -
답변
황규찬님의 답변
2016-09-28- 1
-제가 virus RNA를 RT-PCR(random primer, oligo dT를 이용했습니다.) 해서
forward primer, reverse primer를 사용해서 PCR을 하는데 Forward는 제가 제작하고 reverse를 RNA end sequence와 oligo-dT 2 종류로 해서 PCR을 했습니다.. 그런데 안 나타나네요..예상 size는 800bp인데 non-specific위주로 나타납니다.
거의 수십 kb의 sequence 중 마지막 end sequence 500bp 정도만 안나타납니다..
PCR를 활용하여 800bp virus RNA를 증폭하고자 primer를 디자인 할때에 검토사항을 몇가지 나열해 보겠습니다.
1) 증폭하고자 하는 대략 800bp virus RNA가 하나의 단백질 혹은 전사하였을때 단일 RNA로 생성하는지 확인. (원래 virus RNA 혹은 DNA가 intron없이 단일 exon의 연결되거나 혹은 중복되어 전사되기 때문에 확인이 필요)
2) virus가 RNA유래 DNA유래인지 몰라도 virus source가 실험자가 처음 예상했던 virus인지 확인
3) Forward primer와 같이 reverse primer도 알고 있는 sequence로 디자인하거나 nested PCR 수행 (reverse를 RNA end sequence와 oligo-dT로 하였을 경우 특이성이 결여되어 여러 band들이 나타남. 1st PCR product를 template로 하고 nested PCR를 위한 specific primer를 다시 디자인하여 증폭 수행)