2016-11-01
org.kosen.entty.User@7af5e9f4
오요한(sherry4eva)
- 4
안녕하세요,
제가 지금 membrane receptors (FGF receptors) 의 short-peptide tagging (flag따위) 을 계획중에 있습니다.
그런데 간단하게 C-term tagging을 할 수 있는 상황이 아니라 N-term extracellular domain에 internal tagging을 해야 합니다.
(FGF receptors는 N-term에 signal peptide후에 Ig-like domains가 포함된 extracellular domain이 오고 TM이 온 후 cytoplasmic domain이 옵니다)
Signal peptide 바로 뒷쪽으로 tagging하면 되는 것인지 경험있으신 분들의 답변을 부탁드립니다.
혹시 Ig-like domain들 사이에 tagging을 해 보신 분 계실까요?
아니면 extracellular domain 어느곳이라도 tagging을 해 보신 분들의 경험을 듣고 싶습니다.
Tagging후에 기존 receptor의 기능을 문제 없이 잘 수행하는지, tagging detection은 잘 되는지 (ICC) 등을 알고싶습니다.
감사합니다.
제가 지금 membrane receptors (FGF receptors) 의 short-peptide tagging (flag따위) 을 계획중에 있습니다.
그런데 간단하게 C-term tagging을 할 수 있는 상황이 아니라 N-term extracellular domain에 internal tagging을 해야 합니다.
(FGF receptors는 N-term에 signal peptide후에 Ig-like domains가 포함된 extracellular domain이 오고 TM이 온 후 cytoplasmic domain이 옵니다)
Signal peptide 바로 뒷쪽으로 tagging하면 되는 것인지 경험있으신 분들의 답변을 부탁드립니다.
혹시 Ig-like domain들 사이에 tagging을 해 보신 분 계실까요?
아니면 extracellular domain 어느곳이라도 tagging을 해 보신 분들의 경험을 듣고 싶습니다.
Tagging후에 기존 receptor의 기능을 문제 없이 잘 수행하는지, tagging detection은 잘 되는지 (ICC) 등을 알고싶습니다.
감사합니다.
- membrane protein
- tag
- internal tagging
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
배소현님의 답변
2016-11-02- 3
저희 실험실에서는 protein의 N-terminal (Signal peptide 바로 뒤) 에 Flag tag을 달아서 expression한 경우가 자주 있습니다. Flag tag이 size가 크지도 않아서 protein 구조에 크게 영향을 주지도 않고, tag으로서의 역할도 잘 하더군요.
제가 알기로는 FGF receptor의 Ig2 domain과 Ig3 domain에 ligand가 binding 하는 것으로 알고 있습니다. 이미 나와 있는 논문들 중에 Ig2 domain과 Ig3 domain만 따로 expression해서 ligand-bound FGF receptor의 구조를 발표한 것도 있고요. 그래서...제 의견으로는 signal peptide 바로 뒤에 Flag tag을 달거나, 아니면 ligand binding을 방해하지 않도록 Ig2 domain 바로 앞에 다는 방법 중에서 선택하시면 될 것 같습니다.
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답변
장성재님의 답변
2016-11-01- 1
첨부한 논문을 참고하시기 바랍니다. -
답변
오요한님의 답변
2016-11-01- 1
질문자입니다.
윗 분의 답변 정말 감사합니다.
하지만 내용을 살펴보니 제가 궁금한 부분에 대한 결과는 없네요...
그럼 다른 답변을 기다려 보겠습니다.
감사합니다. -
답변
장성재님의 답변
2016-11-02- 1
십년 전쯤의 경험이라서 도움이 될지는 모르겠습니다만, 저는 type II transmembrane protein에 대한 기능 연구를 했었습니다. 때문에 myc, his, GFP 등 다양한 tags를 가진 pDNA를 만들어 사용했었지요. 저의 경우는 리간드의 결합을 위해서 필수적인 extracellular domain은 건드리지 않고 intracellular domain의 말단에 tagging을 했었습니다. 제가 연구했던 수용체는 intracellular domain이 매우 짧고 심플했었지만 tyrosine motif를 가지고 있었고 이 부분에 영향이 없도록 말단 부분에 tagging을 했었습니다.
표적 단백질에 tagging을 하기 위해서는 기본적으로 단백질의 고유 기능에 영향을 주지 않도록 단백질에 구조적인 영향이 없도록 tagging을 하는 것이 중요합니다. 즉, 아시다시피 디자인을 해보고 실제로 발현시켜서 기능에 이상이 없는지 확인을 하시는 것이 필수적이겠지요.
domain과 domain 사이에 붙였던 적도 있었습니다만, localization 등에서 차이가 있어 다시 변경했던 기억이 있습니다.
tagging에 따른 분자적 변화가 연구의 목적이 아니시라면 유사한 FGFR을 표적으로 한 연구의 주요 연구자에게 이메일을 보내서 plasmid를 제공받아 사용하시는 것은 어떨까요?
많은 도움을 못드려 죄송하네요.ㅜㅜ
감사합니다~! 덕분에 많은 도움이 되었습니다.