2016-11-17
org.kosen.entty.User@146f605b
김동수(111denniskim)
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혈액단핵구를 획득하여 배양에 넣고 MSC (CD73+ CD105+)를 분리하려는데 잘안되네요. 중간엽콜로니가 형성안되고 수개월소비중~ ㅠㅠ. 뭐 좀 확실한 tech tip없을까요? 살려주세요.. 메일로 좀 ^^
- 혈액단구
- 중간엽스템셀
- 셀클로닝
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답변 2
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답변
박진성님의 답변
2016-11-17- 4
체크해볼 사항이 많습니다.
1. media 조성
세포가 잘자라는 FBS lot을 써야하고, 기본 media가 aMEM보다는 DMEM이 잘자라는 것 같습니다. IMDM도 괜찮은 듯. MSC배양용으로 나온 시중 판매되는 제품은 잘 골라 써야돼요.
basic FGF를 넣는 것이 잘 자랍니다.
2. 단핵구 분리시
RBC lysis buffer를 오래 사용하면 다른 세포도 damage입으니, 남아있더라도 오래 처리 안하는게 좋을듯.
MNC분리시 너무 깨끗하게 따려고 하지마세요. 오히려 혈소판등이 있는것이 더 잘살아요.
3. 세포분리
처음부터 FACS또는 MACS로 세포를 분리한다음 배양하시나요? 배양 후 분리하시나요?
처음에는 웬만한 세포는 그냥 다 붙이고, media change를 하루 있다가 하세요.
잘 안붙는 경우에는 이틀 혹은 3일까지 두기도 합니다.
4. colony 형성시점
잘자라면 며칠만에 생기지만, 처음부터 별로 없었거나, 너무 harsh하게 MNC를 뽑아냈으면 오래 걸릴 수도 있어요. 눈에 안보인다고 plate를 버리지 말고 2주이상 둬보세요. 물론 media chanage는 해주면서요. 일주일에 두번정도만.
제가 수백번의 경험이 있어서 저한테는 매우 쉬운일이라 생각나는대로 적어봤는데요. 잘 안되는 것 있으시면 다시 물어보세요. -
답변
김동수님의 답변
2016-11-17- 1
통상의 중간엽배양조건을 적용중인데요, MNC를 plating culture하면 어느정도 중간엽 콜로니형성 징조라도 있어야 하는데 그게 없거든요. 배지조성 뭐 이런 부분은 충족한다고 생각됩니다. 말씀주신 3번은 어떤 쪽이 좋은가요? 아무래도 저희가 SOP상 잘못하고 있는 단계가 있는것 같습니다. 플레이트만 보면 꿀꿀해요~
박진성(cooldoc) 2016-11-18colony를 먼저 만들고 세포가 충분히 자란다음에 sorting하는 것이 성공확률이 높습니다. 다만, 이경우 세포의 character가 sorting후 키우는 것과 다를 수 있습니다. cooldoc95@naver.com 정 도움이 필요하시면 메일주세요. 소속과 이름은 밝혀주시고요.
쿨독님 메일컨택가능하신가요? 저희랩 배양연구원에 조언을 좀 해주심 안될까요?