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안녕하세요~ DCF를 사용하여 ROS를 측정하는 것과 관련하여 질물이 있어서 이렇게 글을 남깁니다.
현재 H4 cell에 DCF를 사용하여 ROS를 측정하고 있는데 사실 ROS 측정이야 워낙 많은 KIT와 실험방법이 나와있어서 좀 쉽게 생각하고 있었는데 이게 생각보다 쉽지가 않네요~ㅠㅠ
먼저 저의 실험 방법을 간단히 말씀드리면……….
1. cell seeding in 96 well plate [2 x 10^4]
2. 2일 후, 실험을 진행합니다. [H4 cell이 binding이 좀 약해서 plate에 poly L-lysine를 처리 후 2일 동안 culture 후 실험을 진행합니다.]
3. media를 제거 후 DCF를 최종 2.5uM로 반응시킵니다.
- DCF는 DMSO와 PBS를 사용하여 녹입니다.
- Well에 처리할 때는 opti-MEM 90ul+DCF(25uM) 10ul = TOTAL 100ul
4. CO2 incubator에서 30min간 반응시킵니다.
5. 30min 후 다시 media를 제거하고 (DCF를 제거하고) 제가 처리하고자 하는 물질을 처리 후 CO2 incubator에서 30min간 반응시킵니다. (with opti-MEM)
6. 30min 후 바로 ROS를 유발하는 자극물질을 처리합니다. (저의 실험실의 경우 manganese를 사용합니다.)
7. CO2 incubator에 넣은 후 1h, 2h, 3h 간격으로 측정합니다.
이러한 순서로 진행합니다. 문제는 Manganese + pre-treat를 한 그룹이 Manganese single treat한 그룹보다 ROS가 높거나 차이가 없이 나오는 것입니다. 이미 많은 논문에서 제가 처리하는 물질이 ROS를 감소시킨다는 보고가 있던 물질이기 때문에 반드시 ROS가 감소해야 됩니다만 저의 결과는 그렇지가 않네요~ ㅠㅠ
그리고 auto fluorescence가 매우 심합니다. 이것 또한 문제가 되고 있습니다. 그래서인지 RFU 값이 밴만, 천만 단위까지 나오고 있습니다.
몇가지 생각을 해봤는데
우선 첫 번째로 DCF반응 후 제거한 다음 washing 단계를 거치지 않고 바로 pre-treat로 들어가는데 혹시 이것이 문제가 되는 것일까요? H4 cell이 binding이 워낙 약해서 코팅을 해도 washing을 자주 하면 금방 떨어져서 loss가 생기더라구요. 그래서 가능하면 washing step을 안하고 있는데 이것이 문제가 되지 않았을까 생각했습니다.
두 번째로 DCF 사용 시 반드시 calcium free인 HBSS나 DPBS를 사용해야 하나요? Datasheet에 보니 calcium이 영향을 미칠 수 있다고 나와있던 것 같은데 HBSS나 DPBS가 모두 calcium free 이더라구요~ 그냥 PBS는 calcium이 포함 되어있는 것으로 알고 있습니다. (아~ 참고로 DCF는 Thermo 제품 C6827입니다.)
ROS 때문에 벌써 3주나 고생을 하고있네요~ 혹시 경험이 있으신 분들이 계시면 고견 부탁 드리겠습니다. 항상 하시는 실험 좋은 결과 나오세요~~~~
- DCF
- ROS
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
백아름님의 답변
2017-08-11- 3
DCFDA 성질에 대해 먼저 말씀드려야 할 것 같습니다.
DCFDA는 아시다시피 ROS와 만나면 DCF와 DA로 쪼개지게 됩니다.
이 때 DCF가 형광을 띄게 됩니다.
따라서 DCFDA는 보관부터 공기와 맞닿지 않게 잘 봉해야합니다.
이러한 DCFDA를 세포에 처리하여 ROS level을 측정할 때에는 DCFDA를 처리한 후 10분간만 반응하고, 그 즉시 형광을 측정해야 합니다.
DCFDA의 처리시간이 더 길거나, 처리한 후 배지 교환을 해주더라도 형광을 측정하는데까지 걸리는 시간이 길어지면 DCFDA가 ROS와 계속 반응하면서 형광값이 급격하게 증가하게 됩니다.
아마 96-well plate 상에서 형광을 측정한다고 하니 plate reader로 intensity를 측정하는 것 같네요.
DCFDA는 실험의 가장 마지막 단계에서 앞서 말씀드린 대로 약 10분간만 처리하고 PBS로 세포를 washing 한 후 PBS buffer를 well에 넣은 상태에서 형광을 측정하시는 것을 추천드리고 싶습니다.
또한 시간대별(1,2,3 h)로 관찰하고자 하는 경우, 이미 DCFDA를 이용하여 형광을 측정한 plate는 재측정하지 마시고, 동일한 조건의 plate를 3개 준비하여, 매시간마다 1개의 plate를 측정하는 것이 좋을 것 같습니다. -
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박애리님의 답변
2017-08-11- 2
저희 연구실에서는 96well에 안하고
60파이나 100파이 디쉬에 셀깔고 약물처리 후 모두 끝난뒤에 DCF 를 1h 반응 시킵니다.
그리고 pbs washing을 두번 한다고 하네요
그리고 살아있는 셀 상태 이니까 원래 키우던 배지로 다시 갈아준뒤
저배율에서 꼼꼼히 봐야 ros 염색 된것을 볼수 있다고 해요
원래 잘 안보이는게 정상이라고 합니다
그리고 라이브셀이라 빨리 사진을 찍어야 하고 시간이 지나면 금방 없어진다고 하네요
이렇게 한후 DCF 처리 농도를 modify해보심이 어떠실런지 ... -
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임창임님의 답변
2017-08-18- 1
96웰 플레이트를 사용하시는 특별한 이유가 있는지요?
샘플수가 많지 않다면, FACS를 제안하고 싶습니다.
다른 분들 말씀처럼 ROS의 변화가 심해서 시간별 체크가 필요하고 최적 시간 농도 등을 사전에 결정하신 후 본 실험을 하시면 어떨까요.
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답변
이광호님의 답변
2017-12-29- 1
일단 auto fluorescence가 발생하는 것은 시험 조건이나 시약의 상태, 세포 상태 등에 따라서 변동이 있을 수 있습니다.
그래서 여러번 해서 조건을 잡아야 하는 것인데
kit에서 알려준 메뉴얼 대로 하지말고 auto fluorescence가 많이 나온다고 하면 시약처리의 양을 점차 줄여봐서 알맞은 농도를 찾으시는게 맞습니다.
제 경험에 의하면 과감하게 확 줄여도 됩니다.
또 이 시험에서 가장 중요한것은 wash입니다. wash를 여러번 해줘야 하고 특히나 반응 후 과정에서는
wash를 3번 4번 해줘도 무방하니 여러번 꼼꼼히 해주셔야 합니다.
가끔 시간이 없거나 실수해서 wash를 못하였을 경우 auto fluorescence가 눈에 띄게 증가했었습니다. 이상입니다.
답변 주신 두분 모두 감사드립니다. 특히 wisdomfairy님이 알려주신대로 DCF를 가장 마지막에 10분 만 처리해서 실험을 진행한 결과 원하던 양상의 결과를 얻을 수 있었습니다~ 결과 확인하고 토요일 저녁 아무도 없는 실험실 빌딩에서 혼자 소리질렀네요~ㅋㅋㅋㅋㅋㅋ 정말 감사합니다~^^ 원래 제가 가지고 있는 DCF datasheet에는 DCF를 먼저 처리하고 나중에 타겟 물질을 treat하라고 나와있어서 계속 DCF를 먼저 treat하고 있었는데 이것이 문제였네요~ㅡㅡㅋ
조언주신 분들 모두 감사드립니다. 하시는 실험 모두 좋은 결과만 나오세요~^^/