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지식나눔

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세포 내 calcium 농도 및 변화 측정 방법

2018-09-19 org.kosen.entty.User@74e803a6 박애리(shara0421)
  • 3
세포에 stress를 주는 chemical 처리 후 칼슘농도의 변화를 보고싶어요 
근데 생리학적인 기법으로 접근은 너무 어렵고 
간단하게 세포내 칼슘 변화를 볼 수 있는 실험 방법(생화학이나 분자생물학적) 알고 계시면 공유 부탁드립니다. 

전에 학회에서 칼슘을 면역염색 처럼 염색해서 루미노미터로 정량 가능하다는 제품을 본적이 있긴한데 
사용해본적도 없고 생소해서 혹시나 이런 제품 사용해보신 분이 있다면 어떤지 후기도 좀 부탁드립니다. 
 
  • calcium
  • neurosceince
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답변 3
  • 답변

    이유정님의 답변

    2018-09-27
    • 2
    fluo-4AM 같은 형광물질을 세포로 투과시키고 형광리더기로 시간별로 형광을 읽으면 됩니다.
    fluo-4AM 시약관련 카탈로그들 읽어보세요.
    온도에 따라 빛에 따라 결과가 많이 달라집니다.
    셀이 dish에서 많이 떨어지지 않는 것도 중요합니다.
    답변수정
    fluo-4AM 같은 형광물질을 세포로 투과시키고 형광리더기로 시간별로 형광을 읽으면 됩니다.
    fluo-4AM 시약관련 카탈로그들 읽어보세요.
    온도에 따라 빛에 따라 결과가 많이 달라집니다.
    셀이 dish에서 많이 떨어지지 않는 것도 중요합니다.
    등록된 댓글이 없습니다.
  • 답변

    임창임님의 답변

    2018-09-20
    • 1
     Molecular probe 를 사용하면 쉽게 이미지로 확인할 수 있는 것으로 알고 있습니다.
    아래 참고 사이트입니다.

    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F10489

    그외 여러  칼슘이온 indicator 리스트입니다.
    https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/summary-of-fluorescent-ca2-indicators-available-from-molecular-probes.html


     
    답변수정
     Molecular probe 를 사용하면 쉽게 이미지로 확인할 수 있는 것으로 알고 있습니다.
    아래 참고 사이트입니다.

    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F10489

    그외 여러  칼슘이온 indicator 리스트입니다.
    https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/summary-of-fluorescent-ca2-indicators-available-from-molecular-probes.html


     
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  • 답변

    김민경님의 답변

    2018-09-21
    • 1
    스트레스에 반응하는 어떤 기전을 확인하려고 하시는지는 모르겠으나, 세포가 activation하면 세포외에서 내부로 칼슘이 유입되면서 칼슘 농도가 올라가게되는데, 그것을 형광이미지로 확인가능하게하는 기술이 칼슘이미징입니다.

    위에 답변해주신 분처럼 해당 사이트에서 indicator라고 하는 것을 구입하시면 되며, 이미징하고자하는 파장대별로 다양하게 판매하고있습니다.
    저는 Flou-4와 OGB-488, Xrhod등 다양하게 사용해보았는데, 각각의 indicator별 반응 특성이 다르기 때문에 잘 확인해 보시고 적합한 것을 결정하여 사용하시는게 좋습니다.
    해당 인디케이터나, Ca2+imaigng, Ca2+ transients등의 키워드로 찾아보시면 다양한 자료를 찾아보실 수 있을 겁니다. 전 참고로 실험 Method를 찾아볼 때 JOVE를 자주 이용하는 편입니다.
     
    저는 주로 컬쳐된 다양한 뉴런을 이용한 실험을 실행하였으며, 여러가지 타입을 써봤지만 저의 경우는 35파이 컬쳐디쉬기준으로 10 x 50 µg로 분지되어있는 AM타입의 indicator를 1/10로 앨리컷 한 것을 PBS 1ml에 녹인 후 사용하였습니다.

    참고로 indicator가 분말형태이기때문에 어떤 미디엄에 어떻게 녹여서 로딩하는지가 매우 중요합니다. 저희는 앨리컷을 할 때도 논문들을 참고하여 다양한 미디엄을 사용하였는데, 그때마다 실패를 많이 반복했습니다. 어떤 세포인지, 어떤 온도, 습도인지 모든 변수에 달라지기 때문에 다양한 논문을 서치하셔서 방법을 찾아보시는게 좋습니다.

    논문을 찾아보시면 아시겠지만, 대부분 농도는 비슷하지만 미디엄을 다르게 사용합니다.
    저의경우는 Pluornic acid (50ul)로 녹인 후, 1/10로 분지하여 한 바이알당 PBS 1ml를 섞어 세포에 로딩후 30-40분정도 인큐베이팅 시키고 워시한 후 배지를 넣고 다시 30분정도 안정화 시키고 이미징 실험을 진행합니다.

    온도와 농도가 중요합니다. 세포 상태도 중요하구요. 그건 실험에 따라 달라질 것이라 해보시면서 조건을 잡는게 제일 중요하다고 말씀드리고 싶습니다.
    도움이 되었길 바랍니다.

     
    답변수정
    스트레스에 반응하는 어떤 기전을 확인하려고 하시는지는 모르겠으나, 세포가 activation하면 세포외에서 내부로 칼슘이 유입되면서 칼슘 농도가 올라가게되는데, 그것을 형광이미지로 확인가능하게하는 기술이 칼슘이미징입니다.

    위에 답변해주신 분처럼 해당 사이트에서 indicator라고 하는 것을 구입하시면 되며, 이미징하고자하는 파장대별로 다양하게 판매하고있습니다.
    저는 Flou-4와 OGB-488, Xrhod등 다양하게 사용해보았는데, 각각의 indicator별 반응 특성이 다르기 때문에 잘 확인해 보시고 적합한 것을 결정하여 사용하시는게 좋습니다.
    해당 인디케이터나, Ca2+imaigng, Ca2+ transients등의 키워드로 찾아보시면 다양한 자료를 찾아보실 수 있을 겁니다. 전 참고로 실험 Method를 찾아볼 때 JOVE를 자주 이용하는 편입니다.
     
    저는 주로 컬쳐된 다양한 뉴런을 이용한 실험을 실행하였으며, 여러가지 타입을 써봤지만 저의 경우는 35파이 컬쳐디쉬기준으로 10 x 50 µg로 분지되어있는 AM타입의 indicator를 1/10로 앨리컷 한 것을 PBS 1ml에 녹인 후 사용하였습니다.

    참고로 indicator가 분말형태이기때문에 어떤 미디엄에 어떻게 녹여서 로딩하는지가 매우 중요합니다. 저희는 앨리컷을 할 때도 논문들을 참고하여 다양한 미디엄을 사용하였는데, 그때마다 실패를 많이 반복했습니다. 어떤 세포인지, 어떤 온도, 습도인지 모든 변수에 달라지기 때문에 다양한 논문을 서치하셔서 방법을 찾아보시는게 좋습니다.

    논문을 찾아보시면 아시겠지만, 대부분 농도는 비슷하지만 미디엄을 다르게 사용합니다.
    저의경우는 Pluornic acid (50ul)로 녹인 후, 1/10로 분지하여 한 바이알당 PBS 1ml를 섞어 세포에 로딩후 30-40분정도 인큐베이팅 시키고 워시한 후 배지를 넣고 다시 30분정도 안정화 시키고 이미징 실험을 진행합니다.

    온도와 농도가 중요합니다. 세포 상태도 중요하구요. 그건 실험에 따라 달라질 것이라 해보시면서 조건을 잡는게 제일 중요하다고 말씀드리고 싶습니다.
    도움이 되었길 바랍니다.

     
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