2020-10-12
org.kosen.entty.User@2add4ba
김헌성(toymusic1)
- 5
안녕하세요
저는 DH5a를 이용하여 Heat shock transforamtion을 하고 있습니다.
그런데 DH5a를 구매한 것을 불려서 사용하는데요
0.1M CaCl2를 이용하여 불리는 작업을 하였습니다.
그런데 성능이 불리기 전 구매한 DH5a보다 완전 떨어지는 것을 확인했습니다.
원인이 무엇인지 궁금합니다.
전문가 선생님들의 말씀부탁드립니다.
감사합니다.
저는 DH5a를 이용하여 Heat shock transforamtion을 하고 있습니다.
그런데 DH5a를 구매한 것을 불려서 사용하는데요
0.1M CaCl2를 이용하여 불리는 작업을 하였습니다.
그런데 성능이 불리기 전 구매한 DH5a보다 완전 떨어지는 것을 확인했습니다.
원인이 무엇인지 궁금합니다.
전문가 선생님들의 말씀부탁드립니다.
감사합니다.
- DNA
- transformation
- DH5a
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 5
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답변
한민준님의 답변
2020-10-13- 4
컴 셀 만들때 몇가지 유의사항이 있는데 아래와 같습니다.
1. 먼저 fresh한 competent cell을 사용해야 합니다.
LB (항생제 없는)에 streaking colony pick up하셔야 하구요
2. 5-10mL start culture 하고 (overnight)
3. 1L culture해서 OD가 0.4 되었을때 centrifuge해서 cell 얻어야 합니다.
4. 이 후 모든 작업은 ice에서 진행
5. Aliquot 50-100 μL into sterile 1.5 mL (가끔 귀찮다고 1mL씩 aliquot해서 다시 사용하는 사람 있는데 한번 꺼낸 com cell은 다시 사용하면 절대 노 노...)
이런 부분만 잘 지켜서 진행하면 꽤 좋은 com cell 만들어 사용할 수 있습니다.
전 이전에 site-directed mutagenesis시키는 것도 직접 만들어 사용했습니다..
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장성재님의 답변
2020-10-13- 3
제가 클로닝 입문하던 20여년 전에는 대부분의 랩에서 컴셀 stock을 1년에 한번씩 수백개 stock 만들어서 보관 후 사용했었는데 (물론 효율 테스트는 필수입니다), 최근에는 효율 좋은 제품 즉석에서 구매해서 많이들 사용하는 것 같던데....
윗 분 말씀처럼 컴셀 제조법에도 다양한 레시피가 있으니, 본인의 레시피와 비교해 보시고 좋은 프로토콜을 재정립하시는 편이 좋을 것 같네요. -
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이평강님의 답변
2020-10-27- 2
Hanahan method라고 MnCl2를 이용하여 하는 방법을 이용하시면 훨씬 높은 transformation 효율을 얻을 수 있습니다. Comp cell 자체 제작 시 세포가 굉장히 약하므로 vortex는 절대 하시면 안되구요 gentle하게 resuspension하는 과정이 번거롭지만 효율을 높입니다. -
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이광호님의 답변
2020-11-19- 1
저도 위에 분의 답변에 동의합니다.
배우기도 그렇게 배웠고 실수로 진행해본 경험으로는 vortex나 tapping이나 이런 방법을 취하였을때 결과가 안좋았습니다.
윗분 말씀대로 뭔가 손가락 스냅이나 이런것들일 이용해서 suspension 몇 번 정도만 하는것이 효율이 높았습니다.
이런 기본적인 스킬이 아니라면. 아마 cell 자체에 문제가 왔을 거 같습니다. 가장 좋은 방법은 새로 구매해서 비교해보는 것이 시간과 고민을 줄일 수 있습니다. 구매회사를 바꾸는 것도 방법입니다. -
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김정인님의 답변
2021-05-07- 1
competent cell 을 만드는 방법에 있어서 차이가 나기 때문일 겁니다.
엔지노믹스 competent cell과 비교했을 때 거의 같은 효율이 나오게 하는 방법이 (엔지노믹스에서는 어떤 방법을 사용하는지 모릅니다.) Inoue method 입니다. 워낙에 효율이 좋아서 supercompetent cell 만드는 방법으로 알려져 있습니다.