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PCR primer를 구매한 후 cDNA로 test를 했습니다.
GAPDH는 잡밴드 없이 잘 뜨는데 primer만 계속 잡밴드가 여러 개 나옵니다.
그래서 같은 gene을 target으로 하는 다른 primer를 구매해서 동일한 sample에 test해봐도 계속 GAPDH는 잘 나오고
구매하는 primer만 이상하게 계속 잡밴드가 나옵니다. Primer를 한 5번은 새로 구매하면서 test한 것 같네요.
원래는 primer쌍이 exon을 겹치지 않게 디자인 하는데 이번에 보려는 gene은 exon이 1개라서 어쩔 수 없이 겹치게 디자인 했습니다.
Primer끼리 dimer는 형성하지 않았구요, primer 짤 때 PCR product가 100~200사이가 되도록 했습니다.
GC 비율은 50%대이고 Annealing 온도도 바꿨지만 여전히 잡밴드가 나오고,
taq이 문제인가 싶었지만 동일한 taq으로 genotyping이라던가 다른 PCR을 하면 또 잘 됩니다.
가끔보면 cDNA의 1st strand 혹은 2nd strand만 사용할 수 있는 PCR taq이 있던데, 제가 사용한 taq은 둘 다 사용가능하구요
지금 제일 의심 되는게 cell에서 RNA prep할 때 DNA가 같이 prep됐는지가 가장 의심스럽습니다.
Column으로 RNA prep을 하는 kit를 사용 중이고, 중간에 DNase I을 colum에 뿌리고 반응시키는 과정이 있는데
제가 사용했던 DNase가 물에 녹여서 냉장고에 있는 상태로 꽤 오래 됐던 걸로 기억하거든요
그게 제대로 작용을 안 해서 DNA 오염인가 싶은데 GAPDH가 one band로 잘 나와서 그건 또 아닌가 싶습니다.
DNA 오염일 가능성이 있을까요?
혹은 다른 문제점이 있을까요?
- PCR
- primer
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
조재형님의 답변
2024-08-24- 0
primer 길이를 좀 더 늘려서 specificity를 높여 주는 방법, 그리고 annealing temp를 좀더 올려보거나 gradinet를 걸어서 band pattern을 확인하고 온도에 의한 원인인지 primer의 binding specificity 에 문제인지 확인을 하고 넘어가 보시면 좋겠습니다.
house keeping gene은 잘 나온다는걸 보면 PCR 자체는 문제가 없는듯 보입니다.