2008-07-11
org.kosen.entty.User@1ab525e7
박재영(love8133)
- 1
제가 콘트롤 하는 protein domain이 계속 agreggate로 나와서 고민이 많습니다.
아미노산 100개짜리고 대략 10kDa정도 나옵니다.
아미노산 구성은
8 Arginine (R)
9 Asparagine (N)
6 Aspartic Acid (D)
1 Glutamic Acid (E)
7 Glycine (G)
1 Lysine (K)
3 Proline (P)
12 Serine (S)
이렇게 되는데 이 구성만 가지고 Solubility를 계산하면
The input protein sequence has a 95.8 percent chance of insolubility when overexpressed in E. coli.
--------------------------------------------------------------------------------
The input sequence is 100 amino acids long and has a CV-CV' value of 2.78.
이렇게 나옵니다.
(물론 95.8%라는 수치를 믿지는 않습니다. 단순 아미노산 구성만 가지고 본것이니)
어쨌든..
벡터를 바꿔서 클로닝을 해봐도 insoluble
chaperone protein이랑 co-expression 시키면 일단은 soluble로 넘어가기는 하는데
column 걸어서 1차로 purify 해 놓으면 받아놓은 fraction에서 농도 높은 순서대로
time-dependent하게 agreggation됩니다.
(이때, NaCl 농도가 500mM 이었는데 뭐 할말이 없죠..ㅡㅡ)
MBP fusion protein 만들면 cell lysate에서는 분명 MBP-내꺼 단백질 fusion protein으로 존재하는데 이걸 amylose colume에 걸면 column work하는 동안 MBP 에서 떨어져서 unbound로 빠져버리는듯 합니다.
(unbound에 band로 보이면 column을 다시 한번 걸어보겠는데 degradation되는지 band가 없어져 버려서...ㅡㅡ)
8M urea로 refolding 시키면 dialysis 한 직후에는 soluble 하다가 다시 agreggation됩니다.
pH 5~10 사이 buffer에서도 녹아있는 컨디션을 못찾았습니다..
이거 뭐..
다른 fusion protein을 만든다 하더라도 clevage 시키면 다시 agreggation될게 눈에 벌써 보여버리니 일하기가 싫어져 버리는군요..
아 뭐 획기적인거 없을까요?
stable 하고 soluble한 form의 단백질을 얻는 방법..ㅡㅡ
- agreggation
- insoluble
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
박재봉님의 답변
2008-07-19- 0
>제가 콘트롤 하는 protein domain이 계속 agreggate로 나와서 고민이 많습니다. > >아미노산 100개짜리고 대략 10kDa정도 나옵니다. >아미노산 구성은 > >8 Arginine (R) >9 Asparagine (N) >6 Aspartic Acid (D) >1 Glutamic Acid (E) >7 Glycine (G) >1 Lysine (K) >3 Proline (P) >12 Serine (S) > >이렇게 되는데 이 구성만 가지고 Solubility를 계산하면 > >The input protein sequence has a 95.8 percent chance of insolubility when overexpressed in E. coli. > >-------------------------------------------------------------------------------- >The input sequence is 100 amino acids long and has a CV-CV' value of 2.78. > >이렇게 나옵니다. >(물론 95.8%라는 수치를 믿지는 않습니다. 단순 아미노산 구성만 가지고 본것이니) > > >어쨌든.. > >벡터를 바꿔서 클로닝을 해봐도 insoluble > >chaperone protein이랑 co-expression 시키면 일단은 soluble로 넘어가기는 하는데 >column 걸어서 1차로 purify 해 놓으면 받아놓은 fraction에서 농도 높은 순서대로 >time-dependent하게 agreggation됩니다. >(이때, NaCl 농도가 500mM 이었는데 뭐 할말이 없죠..ㅡㅡ) > >MBP fusion protein 만들면 cell lysate에서는 분명 MBP-내꺼 단백질 fusion protein으로 존재하는데 이걸 amylose colume에 걸면 column work하는 동안 MBP 에서 떨어져서 unbound로 빠져버리는듯 합니다. >(unbound에 band로 보이면 column을 다시 한번 걸어보겠는데 degradation되는지 band가 없어져 버려서...ㅡㅡ) > >8M urea로 refolding 시키면 dialysis 한 직후에는 soluble 하다가 다시 agreggation됩니다. > >pH 5~10 사이 buffer에서도 녹아있는 컨디션을 못찾았습니다.. > > > >이거 뭐.. >다른 fusion protein을 만든다 하더라도 clevage 시키면 다시 agreggation될게 눈에 벌써 보여버리니 일하기가 싫어져 버리는군요.. > > > >아 뭐 획기적인거 없을까요? > >stable 하고 soluble한 form의 단백질을 얻는 방법..ㅡㅡ > 제가 aggregate 단백질을 안 다뤄봐서 모르지만 일반적으로 막 단백질등은 detergent 상태에서 녹이는데 mild한 detergent 즉 NP-40, tween-20, tritonX-100등을 써보시면 어떨까요? Dialysis 직후에 souble하면 바로 gycerol등을 넣어 aliqout를 만들고 -70도에 얼렸다가 쓰시면 어떨까요?