2008-08-06
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전상옥(lyoovue2nd)
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sephadex column을 이용하여 펩타이드를 분리하고자 할 때 분리 조건을 설정하려고 하는데 이때 packing하는 resin의 양, mobile phase, flow rate, sample injection volume 등은 무엇을 고려하여 결정을 해야하는지 그리고 HPLC의 분석조건을 이러한 컬럼을 이용한 분석조건에 사용을 할 수 있는지 궁금합니다
- sephadex column
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답변 2
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답변
이상후님의 답변
2008-08-09- 0
> sephadex column을 이용하여 펩타이드를 분리하고자 할 때 분리 조건을 설정하려고 하는데 이때 packing하는 resin의 양, mobile phase, flow rate, sample injection volume 등은 무엇을 고려하여 결정을 해야하는지 그리고 HPLC의 분석조건을 이러한 컬럼을 이용한 분석조건에 사용을 할 수 있는지 궁금합니다 > Packing하는 레진의 양은 정확한 packing(중력에 의해 layer가 없는) 상태로 되는가를 먼저 체크해야 되고 보통 column길이에 따라서 결정되어지는데, 오픈 컬럼일 경우에는 peristaltic pump에 연결한 후에 중력으로 충진해서 사용하면 됩니다. 분리하고자 하는 샘플과 분자량이 매우 크게 차이가 나지 않는 불순물들과 섞여 있다면 컬럼 길이를 약간 길게 사용하여 레진을 충진하여 사용하시면 좋은 resolution으로 분리할 수 있을 것입니다. mobile phase는 우선 Sephadex에 안정한 용매인지를 확인해야 하며, 두번째로 샘플과 친화성이 있는지를 확인해서 결정해야 합니다. Sephadex 레진이면 수용성 샘플을 사용한다는 의미이므로 보통 생물학적 버퍼를 이동상으로 반드시 사용해야 할 것으로 생각됩니다. 유속 역시 너무 느려도 너무 빨라도 분해능에 영향을 미치므로 유속에 따른 분해능 또는 컬럼 길이와의 관계식(또는 그래프; 분석화학책을 참고)를 참고하시어 결정하시면 될 것으로 생각됩니다. 보통 0.5~1ml/min에서 결정해서 사용하시라고 말씀드리고 싶습니다. 시료 injection volumn은 이론적으로 충진 volumn의 0.5% 이하로 농축해서 로딩할 수 있습니다. 그러나 실제 시료 주입량은 컬럼 길이와 유속에 따라서 결정해야 됩니다. 시료양이 많게 되면 diffusion현상이 일어나게 되어 분해능과 선택성이 떨어지게 됩니다. HPLC의 분석조건은 오픈 컬럼상에서의 조건과 크게 다르다고 할 수 있습니다. 왜냐하면 오픈 컬럼은 low pressure가 가해지고 HPLC는 high pressure가 가해지므로 여러가지 면에서 같지 않습니다. 용매 선택의 경우도 HPLC의 경우는 컬럼과 시료 둘다를 고려해서 결정해야 됩니다. 물론 HPLC의 경우 시료 주입양도 대개 20 micro liter syringe로 그 이하의 양을 주입하게 됩니다. -
답변
안길홍님의 답변
2010-01-29- 0
>sephadex column을 이용하여 펩타이드를 분리하고자 할 때 분리 조건을 설정하려고 하는데 이때 packing하는 resin의 양, mobile phase, flow rate, sample injection volume 등은 무엇을 고려하여 결정을 해야하는지 그리고 HPLC의 분석조건을 이러한 컬럼을 이용한 분석조건에 사용을 할 수 있는지 궁금합니다 첨부자료