KOSEN 한인과학기술자네트워크

제가 사용하는 1X transfer buffer 입니다. 1L : 5.8 g Tris base + 2.9 g Glycine + 3.7 ml 10% SDS + 200 ml Methanol/1L mini transfer kit(Bio-Rad) 에서 transfer 시에 150 mA 로 놓으면 50-60V 정도 걸립니다. transfer 는 오래해도 상관없습니다. 저는 2시간 이상... 바쁘면 4-5 시간도 둡니다. overnight 상관없습니다. mini transfer kit 에 아이스 박스 넣으면 온도가 뜨거울 정도로 올라가지는 않습니다. membrane 을 methanol 에 적신 후 따로 버퍼에 옮겨 보관할 필요는 없습니다. 바로 transfer 에 사용하세요. 버퍼에 pH 를 맞출 필요는 없습니다. 버퍼 보관은 상온입니다. 4'C 에 보관하면 SDS 가 침전 될수 있습니다. gel 의 % 나 두께가 전압에 미치는 영향은 미미 합니다. 단 transfer 된 단백질 양에 차이가 있을수는 있습니다. 그냥 맘편히 오래 transfer 해도 무관합니다. big transfer kit 에 사용시 150-200mA 걸어주면 대략 20-30V 걸리며 이 경우 overnight 해 줍니다. midi transfer kit 에 사용시도 비슷하게 해주면 됩니다. 그럼 잘 되시길... >안녕하세요. >제가 계속 Transfer를 할때면 0.4A 부근에서 시작합니다. >젤은 길이가 좀 긴젤이구요 10%이며, 2판을 트랜스퍼합니다. >트랜스퍼 버퍼는 트리스와 glycine만 들어가고 1L 당 메탄올 200ml을 넣고 >버퍼를 만듭니다. 트리스와 글리신을 다녹이고 total vol. 750ml인 상태에서pH8.5로 맞춘뒤, 800ml로 맞춥니다. 그뒤 메탄올을 200ml 넣고, stir 10초 정도한뒤, 500ml나누어서 2통에 담고 4도에 보관합니다. > >트랜스퍼할 때는 가능한 버퍼를 상온에 잠시 두고 시작합니다,. >membrane은 PVDF입니다. (메탄올로 activation시킨뒤, 트랜스퍼 버퍼에 담은채, 트랜스퍼 할때까지 상온에 둡니다.(당일날 트랜스퍼하고, SDS gel running할때 준비합니다.) 그뒤 트랜스퍼를 하게되면, 처음 쓰는 트랜스퍼버퍼인데도 불구하고 100V에서 0.38A로 시작하더니 10분도 안되어서 0.40으로 증가합니다. >도저히 안되어서 90V에서 낮추고 하니 한 30분지나서 또 0.40A로 되어버려서 85V에서 2시간 정도 합니다. > >다른 분들이 만들고 쓰던 버퍼를 사용해도, 다른 분들이 만든 새 버퍼를 사용해도 제가 할때만 A가 유독증가하고, 다른 분들은 100V에서 0.29A나 0.35A정도나옵니다. 제가 할때만 100V에서 0.39A로 됩니다.다른분들은 보통 길이의 10%젤을 사용합니다. 원래 100V에서 1시간 반을 해야하나 저는 잘안되어서 80V에서 2시간정도 합니다. 그래도 버퍼나 젤이 뜨겁다는 것을 느낍니다. 잘 트랜스퍼가 되지도 않구요.. >제가 어디를 이상하게 하기에 이렇게 트랜스퍼가 안될까요?? ㅠ.ㅠ >몇개월동안 샘플만 날리네요...ㅠㅠ. 도와주세요..

앞서 구체적으로 좋은 답변주셨는데, 질문자님이 궁금하신 내용에 조금이나마 도움될까봐 그 원리를 말씀드립니다. 우선 핵심은 트랜스퍼 버퍼를 상온에 보관하셔야 하는 거구요, 4도에 보관하셨다면 상온에서 천천히 stirring을 해줘야 하는데, 버퍼의 물질마다 다르겠지만 제 생각엔 12시간 이상 해줄 필요가 있다고 봅니다. 그리고 그 원리를 살펴보면, 같은 용매 조성에 같은 질량의 용질이 녹아있어도 그 용액의 상태에 따라 전기전도성이 다를 수 있다는 겁니다. 예를 들어 순수한 물의 전기전도도는 낮지만, 극미량의 불순물이 들어가면 전기전도도는 급격히 올라갑니다. 불순물이 없더라도 여러 물질이 녹아있는 용액에서는 그 용질의 입자 사이즈에 따라 전기전도성이 달라집니다. 분자레벨로 고르게 분산되어 있다면 전기에너지가 트랜스퍼 흐름에 집중되어 트랜스퍼 효율도 높아지지만(분리 시간이 짧아지겠지요), 여러 분자가 뭉친 상태로 존재한다면 전기에너지가 입자끼리의 충돌이나 전환 등으로 열 등의 다른 에너지로 전환되며, 그 만큼의 에너지가 트랜스퍼 효율이 떨어지는 결과로 이어지겠지요. 참고로 분산된 용액에서의 입자 사이즈가 작을수록 good dispersion이고 클수록 poor dispersion입니다. 논문이나 자료 검색에 참조하세요. >안녕하세요. >제가 계속 Transfer를 할때면 0.4A 부근에서 시작합니다. >젤은 길이가 좀 긴젤이구요 10%이며, 2판을 트랜스퍼합니다. >트랜스퍼 버퍼는 트리스와 glycine만 들어가고 1L 당 메탄올 200ml을 넣고 >버퍼를 만듭니다. 트리스와 글리신을 다녹이고 total vol. 750ml인 상태에서pH8.5로 맞춘뒤, 800ml로 맞춥니다. 그뒤 메탄올을 200ml 넣고, stir 10초 정도한뒤, 500ml나누어서 2통에 담고 4도에 보관합니다. > >트랜스퍼할 때는 가능한 버퍼를 상온에 잠시 두고 시작합니다,. >membrane은 PVDF입니다. (메탄올로 activation시킨뒤, 트랜스퍼 버퍼에 담은채, 트랜스퍼 할때까지 상온에 둡니다.(당일날 트랜스퍼하고, SDS gel running할때 준비합니다.) 그뒤 트랜스퍼를 하게되면, 처음 쓰는 트랜스퍼버퍼인데도 불구하고 100V에서 0.38A로 시작하더니 10분도 안되어서 0.40으로 증가합니다. >도저히 안되어서 90V에서 낮추고 하니 한 30분지나서 또 0.40A로 되어버려서 85V에서 2시간 정도 합니다. > >다른 분들이 만들고 쓰던 버퍼를 사용해도, 다른 분들이 만든 새 버퍼를 사용해도 제가 할때만 A가 유독증가하고, 다른 분들은 100V에서 0.29A나 0.35A정도나옵니다. 제가 할때만 100V에서 0.39A로 됩니다.다른분들은 보통 길이의 10%젤을 사용합니다. 원래 100V에서 1시간 반을 해야하나 저는 잘안되어서 80V에서 2시간정도 합니다. 그래도 버퍼나 젤이 뜨겁다는 것을 느낍니다. 잘 트랜스퍼가 되지도 않구요.. >제가 어디를 이상하게 하기에 이렇게 트랜스퍼가 안될까요?? ㅠ.ㅠ >몇개월동안 샘플만 날리네요...ㅠㅠ. 도와주세요..