2009-04-24
org.kosen.entty.User@32794f75
김유정(99mang)
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stable cell line 만들려고 하는데 실패해서 이렇게 조언을 구합니다~
gfp가 달린 retro vector인데요...
retro virus는 host cell의 chromosome에 끼어들어가기 때문에
infection 후 gfp 발현 확인 후 96 well plate에 well당 한 cell들어가게 해서
cloning 과정 거쳐서 western 확인해 봤는데,, down이 안되드라구요..
shRNA sequence는 논문에 나와 있는걸로 해봤거든요..
retro vector라서 gfp발현만 확인하고 antibiotic처리는 안했는데,,
혹시 antibiotic을 처리해야하나요??
그리고 아무리 찾아봐도 원리가 안나와서 그러는데요
virus vector는 chromosome에 들어가기 때문에 stable cell이 만들어진다지만요..
보통 shRNA 만드는 vector가지고 stable cell line을 만들 때는 antibiotic 처리를 통해 어떻게 cell
안에서 shRNA vector가 계속 유지가 되어 stable cell line이 만들어지는 넘 궁금합니다..
꼭 답변 부탁드려요^^
- stable cell
- retor virus
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답변 3
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답변
이용원님의 답변
2009-04-26- 3
Retrovial vector를 사용한 경우라고 하더라도 antibiotics를 사용하셔야 합니다. 아마 제조사의 manual을 참고하셔도 동일하게 suggestion할 겁니다. Antibiotics의 사용은 stable cell을 선별하는 데 있습니다. 다시 말해, foreign DNA가 integration되지 않은 세포를 제거하는 것이지요. Antiobiotics를 사용하지 않을 경우, foreign DNA가 integation되지 않은 세포들도 마치 stable cell 처럼 자라기 때문에 반드시 병행해야 합니다. >stable cell line 만들려고 하는데 실패해서 이렇게 조언을 구합니다~ >gfp가 달린 retro vector인데요... >retro virus는 host cell의 chromosome에 끼어들어가기 때문에 >infection 후 gfp 발현 확인 후 96 well plate에 well당 한 cell들어가게 해서 >cloning 과정 거쳐서 western 확인해 봤는데,, down이 안되드라구요.. >shRNA sequence는 논문에 나와 있는걸로 해봤거든요.. > >retro vector라서 gfp발현만 확인하고 antibiotic처리는 안했는데,, >혹시 antibiotic을 처리해야하나요?? > >그리고 아무리 찾아봐도 원리가 안나와서 그러는데요 >virus vector는 chromosome에 들어가기 때문에 stable cell이 만들어진다지만요.. >보통 shRNA 만드는 vector가지고 stable cell line을 만들 때는 antibiotic 처리를 통해 어떻게 cell >안에서 shRNA vector가 계속 유지가 되어 stable cell line이 만들어지는 넘 궁금합니다.. > >꼭 답변 부탁드려요^^ -
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전정용님의 답변
2009-06-11- 0
GFP발현여부로는 infection효율이 얼마나 되는지 확인하는 것 뿐이구요, 실제 실험을 하려면 infection되지 않는 세포들의 영향을 제거하기 위해 antibiotic을 처리하여 infection된 세포들만 가지고 실험을 하게 됩니다. 당연히 antibiotic처리를 해야하구요, 언제까지 처리해야하는지 정학한 시점을 알 수 없기 때문에 infection시키지 않은 세포(control)와 동일한 조건에서 antibiotic을 처리하여 control 세포가 죽을때까지 기다리시고, infection시킨 세포중 남아있는 세포를 키우서 실험하시면 됩니다. shRNA만드는 벡터로 cell line을 만들기는 하지만, 그 효율이 현저히 떨어지기 때문에 오랜시간동아 사용하지 않습니다. selection한 후 한두달내에 실험하시는 것이 가장 정확하고 믿을수 있는 실험 결과를 얻을수 있을겁니다. 질문 자체가 antibiotic 처리 여부를 질문하신건지, shRNA에 의한 유전자의 발현 억제가 잘 안된다는것을 질문하신건지 모호합니다. >stable cell line 만들려고 하는데 실패해서 이렇게 조언을 구합니다~ >gfp가 달린 retro vector인데요... >retro virus는 host cell의 chromosome에 끼어들어가기 때문에 >infection 후 gfp 발현 확인 후 96 well plate에 well당 한 cell들어가게 해서 >cloning 과정 거쳐서 western 확인해 봤는데,, down이 안되드라구요.. >shRNA sequence는 논문에 나와 있는걸로 해봤거든요.. > >retro vector라서 gfp발현만 확인하고 antibiotic처리는 안했는데,, >혹시 antibiotic을 처리해야하나요?? > >그리고 아무리 찾아봐도 원리가 안나와서 그러는데요 >virus vector는 chromosome에 들어가기 때문에 stable cell이 만들어진다지만요.. >보통 shRNA 만드는 vector가지고 stable cell line을 만들 때는 antibiotic 처리를 통해 어떻게 cell >안에서 shRNA vector가 계속 유지가 되어 stable cell line이 만들어지는 넘 궁금합니다.. > >꼭 답변 부탁드려요^^ -
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신동욱님의 답변
2010-01-10- 0
>stable cell line 만들려고 하는데 실패해서 이렇게 조언을 구합니다~ >gfp가 달린 retro vector인데요... >retro virus는 host cell의 chromosome에 끼어들어가기 때문에 >infection 후 gfp 발현 확인 후 96 well plate에 well당 한 cell들어가게 해서 >cloning 과정 거쳐서 western 확인해 봤는데,, down이 안되드라구요.. >shRNA sequence는 논문에 나와 있는걸로 해봤거든요.. > >retro vector라서 gfp발현만 확인하고 antibiotic처리는 안했는데,, >혹시 antibiotic을 처리해야하나요?? > >그리고 아무리 찾아봐도 원리가 안나와서 그러는데요 >virus vector는 chromosome에 들어가기 때문에 stable cell이 만들어진다지만요.. >보통 shRNA 만드는 vector가지고 stable cell line을 만들 때는 antibiotic 처리를 통해 어떻게 cell >안에서 shRNA vector가 계속 유지가 되어 stable cell line이 만들어지는 넘 궁금합니다.. > >꼭 답변 부탁드려요^^ 안타깝네요..한달 가량 세포를 키웠을텐데, Selection도 해야 하므로, Neomycin같은 antibiotics를 반드시 넣어주어야 합니다.